Untersuchungen zur Isolierung und Charakterisierung von Phosphofructokinase-1 aus Rhodotorula glutinis:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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| Beschreibung: | Leipzig, Univ., Diss., 1994 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. AUFGABENSTELLUNG 8
3. MATERIAL UND METHODEN 9
3.1. VERWENDETE STAEMME 9
3.1.1. HEFESTAEMME 9
3.1.2.
E.COLI - STAEMME 9
3.2. VERWENDETE PLASMIDE 9
3.3. MEDIEN FUER DIE ZELLZUCHT 10
3.3.1. HEFE - MEDIEN 10
3.3.2.
E.COLI - MEDIEN 10
3.4. ZELLKULTIVIERUNG 11
3.4.1. ALLGEMEINE HEFE- UND BAKTERIENZELLZUCHT 11
3.4.2. KULTIVIERUNG DER HEFE
RHODOTORULA GLUTINIS 12
3.5. PROTEINANALYTIK 12
3.5.1. ALLGEMEINE METHODEN 12
3.5.1.1. AUFSCHLUSS DER HEFEZELLEN 12
3.5.1.2. HERSTELLUNG VON SPHAEROPLASTEN DER HEFE
RHODOTORULA GLUTINIS 13
3.5.1.3. PROTEINBESTIMMUNG 14
3.5.1.4. BESTIMMUNG DER AKTIVITAET VON PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 14
3.5.2. ANALYTISCHE UND PRAEPARATIVE TRENNMETHODEN 15
3.5.2.1. POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 15
3.5.2.1.1. POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE MIT NATRIUMDODECYLSULFAT 15
3.5.2.1.2. NATIVE POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 17
3.5.2.2. WESTERN BLOT - ANALYSE 21
3.5.2.3. VERTEILUNG IN EINEM WAESSRIGEN ZWEIPHASENSYSTEM 23
3.5.2.4. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 24
3.5.2.5. GRENZFLAECHENAUSSALZUNG VON PROTEINEN 24
(INTERFACIAL SALTING OUT = ISA)
3.5.2.6. GELFILTRATION MIT EINEM FPLC - SYSTEM (FPLC) 25
3.5.2.7. HOCHDRUCKFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE (HPLC) 26
3.5.2.8. GELFILTRATION AN SEPHAROSE 6B 26
3.5.2.9. AFFMITAETSCHROMATOGRAPHIE AN SEPHACRYL-CIBACRONBLAU F3G-A 27
3.5.2.10. KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 27
3.5.2.11. LAGERUNG DER GEREINIGTEN PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/941929957
AUS
RHODOTORULA GLUTINIS
3.5.3. MATHEMATISCHE AUSWERTUNG DER FUER DIE PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 28
ERHALTENEN KINETISCHEN DATEN
3.6. NUKLEINSAEUREANALYTIK 29
3.6.1. ALLGEMEINE TECHNIKEN 29
3.6.1.1. PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL (PCI) - EXTRAKTION 29
3.6.1.2. FAELLUNG DER NUKLEINSAEUREN 29
3.6.1.3. QUANTITATIVE UND QUALITATIVE UNTERSUCHUNG VON NUKLEINSAEUREN 30
3.6.1.4. LAGERUNG DER NUKLEINSAEUREN 31
3.6.1.5. SPALTUNG DER DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 31
3.6.2. DNA-AGAROSEGEL - ELEKTROPHORESE (SUBMERSELEKTROPHORESE) 31
3.6.3. ISOLIERUNG VON DNA AUS EINEM AGAROSEGEL 33
(FREEZE SQUEEZE - METHODE)
3.6.4. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI 34
3.6.5. PRAEPARATION VON CHROMOSOMALER DNA AUS
RHODOTORULA GLUTINIS 35
3.6.6. SYNTHESE VON DOPPELSTRAENGIGER CDNA DER HEFE 35
RHODOTORULA GLUTINIS
3.6.6.1. PRAEPARATION VON RNA 36
3.6.6.2. ISOLIERUNG VON MRNA AUS DER GESAMT RNA VON 37
RHODOTORULA GLUTINIS
3.6.6.3. SYNTHESE DOPPELSTRAENGIGER CDNA MIT ECORI-LINKEM 38
3.6.7. HERSTELLUNG EINER CDNA BANK VON RHODOTORULA GLUTINIS 39
3.6.7.1. DEPHOSPHORYLIERUNG DES VEKTORS MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE 40
(CIP)
3.6.7.2. LIGATION VON CDNA UND VEKTOR 40
3.6.7.3. T RANSFORMATION VON
E. CO/I-ZELLEN 41
3.6.7.3.1. HERSTELLUNG KOMPETENTER
E. COLI-ZELLEN 41
3.6.7.3.2. TRANSFORMATION DES .CO/I'-STAMMES JM 101 41
3.6.8. KONSTRUKTION EINER PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 - SPEZIFISCHEN 42
DNA-SONDE
3.6.8.1. ISOLIERUNG DER DNA-SONDE 42
3.6.8.2. MARKIERUNG DER DNA-SONDE 43
3.6.9. SOUTHERN BLOT - ANALYSE 43
3.6.9.1. SOUTHEM-TRANSFER 43
3.6.9.2. SOUTHEM-HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION 45
3.6.10. POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 46
4.
4.1.
4.1.1.
4.1.2.
4.1.3.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
4.3.
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4
4.4.
4.4.1.
4.4.2.
4.4.2.1.
4.4.2.2.
4.4.3.
4.5.
4.5.1.
4.5.2.
4.6.
4.6.1.
4.6.2
4.6.3.
4.6.4.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
KULTIVIERUNG DER HEFE RHODOTORULA GLUTINIS
OPTIMIERUNG DER WACHSTUMSBEDINGUNGEN
WACHSTUMSKURVE VON RHODOTORULA GLUTINIS
BESTIMMUNG EINES OPTIMALEN ZEITPUNKTS FUER DIE ERNTE DER
HEFEZELLEN
ISOLIERUNG VON PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 AUS
RHODOTORULA GLUTINIS 54
REINIGUNGSVERFAHREN
54
CHARAKTERISIERUNG DES REINHEITSGRADES DER ISOLIERTEN 61
RHODOTORULA-PFK
UNTERSUCHUNGEN ZU PROTEOLYTISCHEN VERAENDERUNGEN DER PHOS-
PHOFRUCTOKINASE-1 IM ROHEXTRAKT VON RHODOTORULA GLUTINIS
DARSTELLUNG DES PROTEOLYTISCHEN ABBAUS DER PFK
AUSSCHLUSS VON MODIFIZIERUNGEN DER RHODOTORULA-PFK
HEMMUNG DER PROTEOLYTISCHEN AKTIVITAETEN IM HEFEROHEXTRAKT
VON RHODOTORULA GLUTINIS
PROTEOLYTISCHE VERAENDERUNGEN AN DER RHODOTORULA-PFK IM
HEFEEXTRAKT DURCH PROTEASEZUSATZ
QUARTAERSTRUKTUR VON PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 AUS
RHODOTORULA GLUTINIS
DARSTELLUNG DER UNTEREINHEITEN
BESTIMMUNG DER RELATIVEN MOLEKUELMASSE VON
PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 AUS RHODOTORULA GLUTINIS
GELFILTRATION DER GEREINIGTEN PFK
NATIVE POLYACRYLAMIDGEL - ELEKTROPHORESE
BESCHREIBUNG DER OLIGOMERSTRUKTUR VON RHODOTORULA-PFK
FUNKTIONELLE STABILITAET DER GEREINIGTEN PHOSPHOFRUCTOKINASE-1
AUS RHODOTORULA GLUTINIS
STABILITAET DER OLIGOMERSTRUKTUR BEI NIEDRIGEN PROTEIN
KONZENTRATIONEN
QUARTAERSTRUKTUR DER GEREINIGTEN RHODOTORULA-PFK IN
GEGENWART UND IN ABWESENHEIT STABILISIERENDER SUBSTANZEN
KINETISCHE EIGENSCHAFTEN DER GEREINIGTEN PHOSPHOFRUCTO
KINASE-1 AUS RHODOTORULA GLUTINIS
FRUCTOSE-6-PHOSPHAT
ATP
FRUCTOSE-2,6-BISPHOSPHAT
CITRAT
65
65
70
72
74
76
76
77
77
79
80
82
82
85
88
89
91
92
94
4.7.
4.7.1.
4.7.2.
4.7.2.1
4.7.2.2
4.7.3.
4.7.4.
4.7.5.
5.
6
.
UNTERSUCHUNGEN ZUR GENETISCHEN CHARAKTERISIERUNG VON
PHOSPHOFRUCTOKINASE-1 AUS RHODOTORULA GLUTINIS
ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS RHODOTORULA GLUTINIS
HERSTELLUNG EINER CDNA BANK VON RHODOTORULA GLUTINIS
SYNTHESE DER CDNA
KLONIERUNG DER CDNA
ANALYSE DER GENOMISCHEN UND DER CDNA BANK VON
RHODOTORULA GLUTINIS DURCH SOUTHERN - HYBRIDISIERUNG
AMPLIFIZIERUNG VON RHODOTORULA-DNA DURCH
POLYMERASE KETTENREAKTION
SEQUENZIEREN EINES PCR-AMPLIFIKATS
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATURVERZEICHNIS
ANHANG
96
97
98
98
99
102
104
110
112
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