Der Einfluss von RNA-Sequenzen und RNA-Strukturen auf die Translationssuppression von HIV-1 und HTLV-2:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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I
NHALTSVERZEICHNIS
SEITE
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
VII
T
ABELLENVERZEICHNIS
X
A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS
XI
1.
EINLEITUNG
1
1.1
GENEXPRESSION
IN
EUKARYONTEN
1
1.2
MECHANISMUS
DER
EUKARYOTISCHEN
TRANSLATION
2
1.2.1
INITIATION
2
1.2.2
ELONGATION
4
1.2.3
TERMINATION
4
13
TRANSLATIONSKONTROLLE
5
1.3.1
POSTTRANSKRIPTIONALE
REGULATION
DER
EXPRESSION
VON
FERRITIN
UND
TRANSFERRINREZEPTOR
6
1.3.2
REINITIATION
7
1.3.3
TRANSLATIONALE
SUPPRESSION
8
1.4
DIE
BEDEUTUNG
DER
TRANSLATIONSSUPPRESSION
FUER
DIE
RETROVIRALE
VERMEHRUNG
11
1.4.1
DIE
SEQUENZVORAUSSETZUNGEN
FUER
DIE
RETROVIRALE
LESERASTERVER
SCHIEBUNG
IN
-1
RICHTUNG
15
1.4.2
DIE
MOEGLICHE
BETEILIGUNG
VON
TRANS-AKTIVEN
FAKTOREN
AM
MECHA
NISMUS
DER
RETROVIRALEN
LESERASTERVERSCHIEBUNG
18
1.4.3
EXPRESSIONSSYSTEM
FUER
DIE
UNTERSUCHUNG
DER
RIBOSOMALEN
LESE
RASTERVERSCHIEBUNG
IN
SAEUGERZEILINIEN
19
1.5
AUFGABENSTELLUNG
22
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
23
2.1
GERAETE
23
2.2
MATERIAL
25
2.2.1
FILTERPAPIERE
25
2.2.2
AUTORADIOGRAPHIE
26
2.2.3
CHEMIKALIEN
26
2.2.4
ANTISEREN
UND
ANTIKOERPER
27
2.2.5
COMPUTERPROGRAMME
UND
DATENBANKEN
27
23
ALLGEMEINE
GNINDTECHNIKEN
27
2.3.1
STERILISIEREN
27
2.3.2
PHENOLEXTRAKTION
/
ETHANOLFAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
2.3.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
VON
NUKLEINSAEUREN
28
2.4
ARBEITEN
MIT
E.
COLI
29
2.4.1
E.
COLI
STAEMME
29
2.4.2
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
29
2.4.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
30
2.4.4
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
PLASMIDEN
31
2.4.5
KONSERVIEREN
VON
BAKTERIENKOLONIEN
31
2.5
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
32
2.5.1
ANALYTISCHE
PLASMIDISOLATION
(MINI-PRAEP
METHODE)
32
2.5.2
PRAEPERATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
32
2.5.3
ISOLIERUNG
VON
HOCHMOLEKULARER
DNA
(HMW-DNA)
AUS
SAEU
GERZELLEN
33
2.5.4
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
GELEN
34
2.5.4.1
ELEKTOELUTION
AUS
AGAROSEGELEN
34
2.5.4.2
ELUTION
MIT
GLASMILCH
AUS
AGAROSEGELEN
35
2.5.4.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
35
2.6
IN-VITRO-ARBELTEN
MIT
DNA
36
2.6.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
36
2.6.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
37
2.6.3
AUFFUELLREAKTION
VON
5'
UEBERSTEHENDEN
ENDEN
MIT
DEM
KLENOW
ENZYM
37
2.6.4
ABBAU
5'
UEBERSTEHENDER
ENDEN
MIT
"MUNG
BEAN"-NUKLEASE
37
2.6.5
DNA-LIGATION
38
2.6.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
38
2.6.6.1
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
38
2.6.6.2
NICK-TRANSLATION
38
2.6.7
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
39
2.7
/N-VITRO-ARBEITEN
MIT
RNA
40
2.7.1
/N-VITRO-TRANSKRIPTION
40
2.7.2
/N-VIRRO-TRANSLATION
40
2.8
GELELEKTROPHORESEN
41
2.8.1
AGAROSEGELE
41
2.8.2
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELE
41
2.8.3
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELE
42
2.8.4
TRICINE-SDS-POLYACRYLAMIDGELE
42
2.9
ZELLKULTURMETHODEN
43
2.9.1
VERWENDETE
ZELLINIEN
43
2.9.2
KULTURMEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
TIERISCHE
ZELLKULTUREN
44
2.9.3
MATERIAL
FUER
ZELLKULTUR
45
2.9.4
KULTURBEDINGUNGEN
45
2.9.5
KULTURBEDINGUNGEN
FUER
F9-ZEILEN
45
2.9.5.1
DIFFERENZIERUNG
VON
F9-ZELLEN
46
2.9.6
PASSAGIEREN
DER
ZELLEN
46
2.9.7
LANGZEITLAGERUNG
VON
ZELLEN
47
2.9.8
GENTRANSFERMETHODEN
47
2.9.8.1
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MITTELS
KALZIUMPHOSPHAT-DNA-PRAEZIPITATION
47
2.9.8.2
STABILE
TRANSFEKTION
48
2.9.9
ZELLERNTE
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
49
2.10
PROTEINANALYTIK
49
2.10.1
PROTEINBESTIMMUNG
49
2.10.2
NACHWEIS
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYLTRANSFERASE
(CAT)
50
2.10.2.1
RADIOAKTIVER
NACHWEIS
DER
CAT-AKTIVITAET
DURCH
UMSATZ
VON
[
14
C]-CHLORAMPHENICOL
51
2.10.2.2
QUANTITATIVER
NACHWEIS
VON
CAT
DURCH
EINEN
CAT-ELISA
52
2.10.3
BESTIMMUNG
DER
LUCIFERASE-AKTIVITAET
51
2.10.4
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
52
2.10.5
BESTIMMUNG
DER
SEAP-AKTIVITAET
52
2.10.6
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
("WESTEMBLOTTING")
53
2.10.7
IMMUNOBLOT-ANALYSE
54
2.10.8
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
54
2.10.8.1
PRAEPERATION
VON
STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
54
2.10.8.2
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
(RIP)
55
2.11
VERWENDETE
OIIGONUKLEOTLDE
55
2.11.1
OLIGONUKLEOTID
FUER
SEQUENZIERUNGEN
55
2.11.2
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
KLONIERUNGEN
56
2.12
VERWENDETE
PLASMIDE
59
2.12.1
PLASMIDE
MIT
SV40/T7-HYBRIDPROMOTOR
59
2.12.1.1
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
SV40/T7-PROMOTOR
62
2.12.2
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
H1V-1
HEPTANUKLEOTID
62
2.12.3
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
HTLV-2
HEPTANUKLEOTID
65
2.12.4
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
HTLV-2
HEPTANUKLEOTID:
VARIATIONEN
DES
SEQUENZKONTEXTES
DES
HEPTANUKLEOTIDS
67
2.12.5
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
HTLV-2
HEPTANULDEOTID:
VARIATIONEN
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
3'
BENACHBART
ZUM
HEPTANUKLEOTID
68
2.12.6
PBGALLUC-PLASMIDE
MIT
HTLV-2
HEPTANUKLEOTID:
VARIATIONEN
DES
ABSTANDHALTERS
ZWISCHEN
HEPTANUKLEOTID
UND
SEKUNDAERSTRUKTUR
70
2.12.7
PLASMIDE
MIT
EISENREGULIERTEN
ELEMENTEN
(IRES)
71
2.12.8
SELEKTIONSPLASMIDE
72
2.12.9
ANDERE
PLASMIDE
73
3.
ERGEBNISSE
74
3.1
UNTERSUCHUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
(GAG-POL
SEQUENZ)
IN
VITRO
74
3.1.1
IN-VITRO-SYSTEM
ZUR
MESSUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
75
3.1.2
MESSUNG
DER
EFFIZIENZ
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
IN
VITRO
77
3.1.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MOEGLICHEN
REINITIATION
BEI
DER
IN-VITRO
TRANSLATION
78
3.1.4
UNTERSUCHUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
IN
AB
HAENGIGKEIT
VON
PRIMAER
UND
SEKUNDAERSTRUKTUR
DER
MRNA
IN
VITRO
80
3.2
UNTERSUCHUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
DER
HTLV-2
GAG-PRO
SEQUENZ
IN
VIVO
87
3.2.1
BESTIMMUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HTLV-2
IN
VIVO
87
3.2.2
DER
EINFLUSS
DES
SEQUENZKONTEXTES
DES
HEPTANUKLEOTIDS
AUF
DIE
EFFIZIENZ
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
92
3.2.3
DER
EINFLUSS
VON
SEQUENZ
UND
STABILITAET
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
AUF
DIE
EFFIZIENZ
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
94
3.2.4
DER
EINFLUSS
DES
ABSTANDES
ZWISCHEN
HEPTANUKLEOTID
UND
SEKUN
DAERSTRUKTUR
AUF
DIE
EFFIZIENZ
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
33
VERGLEICH
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
UND
HTLV-2
IN
VIVO
101
3.3.1
WIRKUNG
VON
SEQUENZELEMENTEN
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNGS
KASSETTEN
VON
HIV-1
UND
HTLV-2
102
3.4
ANALYSE
MENSCHLICHER
GENE
AUF
LESERASTERVERSCHIEBUNGSSEQUENZEN
105
3.4.1
DAS
VORKOMMEN
DES
HEPTANUKLEOTIDES
T
TTT
TTA
106
3.4.2
IDENTIFIZIERUNG
VON
HUMANEN
SEQUENZEN
MIT
HEPTANUKLEOTID
IM
LESERAHMEN
106
3.4.3
BESCHREIBUNG
DER
POTENTIELLEN
LESERASTERVERSCHIEBUNGSORTE
DER
IDENTIFIZIERTEN
HUMANEN
SEQUENZEN
108
33
UNTERSUCHUNG
DES
MOLEKULAREN
MECHANISMUS
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
112
3.5.1
DER
EINFLUSS
VON
CYCLOHEXIMID
AUF
DIE
EFFIZIENZ
DER
LESERASTER
VERSCHIEBUNG
IN
VITRO
112
3.5.2
UNTERSUCHUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
IN
VIVO
IN
ABHAENGIG
KEIT
VOM
DIFFERENZIERUNGSGRAD
VON
SAEUGERZELLEN
116
3.6
REGULATION
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
DURCH
EIN
RNA-BINDEPROTEIN
118
3.6.1
MODELLSYSTEM
FUER
DIE
REGULATION
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
DURCH
EIN
RNA-BINDEPROTEIN
119
3.6.2
DER
EINFLUSS
VON
EISENREGULIERTEN
ELEMENTEN
(IREN)
IN
EINER
LESERASTERVERSCHIEBUNGSKASSETTE
MIT
HIV-1
HEPTANUKLEOTID
AUF
DIE
LESERASTERVERSCHIEBUNGSEFFIZIENZ
121
3.6,2.1
DER
EINFLUSS
ALS
SEKUNDAERSTRUKTUR
122
3.6.2.2
MESSUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
INTRAZELLULAEREN
EISENKONZENTRATION
124
3.6.2.3
MESSUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
BEI
KOEXPRESSION
VON
IRE-BP
(IRE-BINDEPROTEIN)
128
3.6.3
DER
EINFLUSS
VON
EISENREGULIERTEN
ELEMENTEN
IN
EINER
LESERASTER
VERSCHIEBUNGSKASSETTE
MIT
HTLV-2
HEPTANUKLEOTID
135
3.6.3.1
DER
EINFLUSS
ALS
SEKUNDAERSTRUKTUR
135
3.63.2
MESSUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
INTRAZELLULAEREN
EISENKONZENTRATION
137
3.63.3
MESSUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
BEI
KOEXPRESSION
VON
IRE-BP
(IRE-BINDEPROTEIN)
138
98
4.
DISKUSSION
141
4.1
DIE
BESTIMMUNG
DER
EFFIZIENZ
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
VON
HIV-1
IN
VITRO
141
4.1.1
RELEVANZ
DER
/N-VIRRO-EXPERIMENTE
145
4.2
UNTERSUCHUNG
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
DER
HTLV-2
GAG
PRO
REGION
IN
VIVO
147
4.2.1
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
SEQUENZELEMENTE
DER
HTLV-2
LESERASTERVERSCHIEBUNGSKASSETTE
148
4.2.1.1
DIE
"SLIPPERY"
SEQUENZ:
HINWEISE
AUF
EIN
ERWEITERTES
MODELL
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
149
4.2.1.2
DIE
HAAMADELSTRUKTUR:
BEDEUTUNG
VON
SEQUENZ
UND
STABILITAET
153
4.2.1.3
DER
ABSTANDHALTER:
DIE
ANZAHL
DER
NUKLEOTIDE
BESTIMMT
DEN
EINFLUSS
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
156
4.2.2
DER
AUFBAU
DER
HTLV-2
LESERASTERVERSCHIEBUNGSKASSETTE
157
43
DIE
LESERASTERVERSCHIEBUNGSKASSETTEN
VON
HIV-1
UND
HTLV-2:
GEMEINSAMKEITEN
UND
UNTERSCHIEDE
158
4.4
REGULATION
DER
LESERASTERVERSCHIEBUNG
DURCH
EIN
RNA-BINDEPROTEIN
160
4.5
DIE
LESERASTERVERSCHIEBUNG:
EIN
POTENTIELLES
ZIEL
DER
ANTIVIRALEN
THERAPIE?
164
5.
ZUSAMMENFASSUNG
166
6.
LITERATUR
167
LEBENSLAUF |
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