Isolierung und Charakterisierung durch alpha-Faktor abgeschalteter Gene in Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VII, 93 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
EINLEITUNG
.
1
1.
PHEROMONINDUZIERTE
ANTWORTEN
IN
S.
CENVISIAE
.
1
2.
FRAGESTELLUNG
DIESER
ARBEIT
.
5
2.1
VORUEBERLEGUNG
ZUR
SUCHE
NACH
ABGESCHALTETEN
GENEN
.
6
II
ERGEBNISSE
.
7
1.
VON
DER
HEFEZELLKULTUR
BIS
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
A-FAKTOR-ABGESCHALTETER
GENE
.
7
1.1
HERSTELLUNG
EINER
CDNA-GENBANK
.
8
1.2
SUCHE
NACH
A-FAKTOR-ABGESCHALTETEN
GENEN
.
8
1.3
WEITERES
VORGEHEN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
A-FAKTOR-ABGESCHALTETER
GENE
.
9
2.
CHARAKTERISIERUNG
EINZELNER
A-FAKTOR-ABGESCHALTETER
GENE
.
10
2.1
HISTONGENE
.
10
2.1.1
SEQUENZEN
DER
CDNA-FRAGMENTE
.
10
2.1.2
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DER
HISTONGENE
.
11
22
A0.5
.
12
2.2.1
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DES
O0.5-GENS
.
12
2.2.1.1
A-FAKTOR-REGULIERTER
TNRNA-SPIEGEL
.
12
2.2.1.2
TRANSKRIPTION
IN
CDC28-L-ZDLEA
.
13
2.2.1.3
TRANSKRIPTIONSMAXIMUM
AM
ENDE
DES
LOGARITHMISCHEN
WACHSTUMS
.
13
2.2.2
SEQUENZIERUNG
UND
OFFENER
LESERAHMEN
DES
AO.5-GENS
.
15
2.2.3
VORKOMMEN
DES
AO.5-GENS
.
17
2.2.4
DISRUPTION
DES
AO.5-GENS
.
17
2.2.5
UEBEREXPRESSION
DES
A0.5-GENS
.
17
2.2.6
VERSUCHE
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
DES
A0.5-PROTEINS
.
18
2.2.6.1
HERSTELLUNG
UND
ANREICHERUNG
EINES
ANTIKOERPERS
GEGEN
EIN
16-AS-PEPTID
.
18
2.2.6.2
VERSUCHE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
DES
A0.5-PROTEINS
.
19
23
AO.6
.
20
2.3.1
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DES
A0.6-GENS
.
20
2.3.2
SEQUENZIERUNG
UND
OFFENER
LESERAHMEN
DES
AO.6-GENS
.
21
2.3.3
VORKOMMEN
DES
AO.6-GENS
.
23
2.4
AO
.
23
2.4.1
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DES
AO.9-GENS
.
23
2.4.2
SEQUENZIERUNGSARBEITEN
UND
SEQUENZVERGLEICHE
.
25
2.4.3
VORKOMMEN
DES
AO.9-GENS
.
28
2.4.4
DISRUPTION
DES
AO.9-GENS
.
28
2.4.4.1
HERSTELLUNG
AO.9.'.W?A3-DISRUPTIERTER
ZELLEN
.
28
2.4.4.2
TETRADENANALYSE
DIPLOIDER
A0.9/A0.9.-.'TZR43-HETEROZYGOTER
ZELLEN
.
29
INHALTSVERZEICHIIIS
2.4.5
VERSUCHE
ZUR
FUNKTION
DES
AO.9-GENS
.
29
2.4.5.1
WACHSTUM
UND
PROTEINGEHALT
A-FAKTOR-BEHANDELTER
ZELLEN
.
29
2.4.5.2
ARBEITEN
ZUR
HERSTELLUNG
AO.9
KONSTITUTIV
EXPRIMIERENDER
ZELLEN
.
30
23
AL.4
.
32
2.5.1
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DES
OJ.4-GENS
.
32
2.5.2
SEQUENZIERUNGSARBEITEN
UND
SEQUENZVERGLEICHE
.
33
2.5.3
VORKOMMEN
DES
A7.4-GENS
.
35
2.6
A2.S
.
36
2.6.1
VERSUCHE
ZUR
TRANSKRIPTION
DES
A2.5-GENS
.
36
2.6.2
SEQUENZIERUNGSARBEITEN
UND
SEQUENZVERGLEICHE
.
37
2.6.3
VORKOMMEN
DES
A2.5-GENS
.
37
2.7
WEITERE
GENE
.
39
2.7.1
AO.8
.
39
2.7.2
A3.0
.
40
2.7.3
A3.5
.
40
2.7.4
WEITERE
CDNA-KLONE
.
41
M
DISKUSSION
.
42
1.
A-FAKTOR-ABGESCHALTETE
GENE
.
42
2.
DIE
UNTERSUCHTEN
GENE
.
42
2.1
HISTONGENE
.
42
2.1.1
HISTONE
UND
DNA-VERPACKUNG
.
42
2.1.2
HISTONE
ALS
TRANSKRIPTIONSREGULATOREN
.
43
2.1.3
EXPRESSION
DER
HISTONGENE
.
44
2.1.4
A-FAKTOR-BEDINGTE
GENABSCHALTUNG
DER
HISTONGENE
.
45
22
O0.5
.
46
2.2.1
ENTWICKLUNGSABHAENGIGE
TRANSKRIPTION
VON
STRESSPROTEIN-GENEN
.
46
2.2.2
A0.5
-
EIN
STRESSPROTEIN?
.
47
2.2.3
OFFENE
FRAGEN
.
49
2.2.4
SPEKULATIONEN
ZUR
FUNKTION
.
49
23
A0.6
.
50
2.3.1
SED-GENE
.
51
2.3.2
OFFENE
FRAGEN
.
52
2.4
AO.9
.
52
2.4.1
A0.9
PROZESSIERT
RIBOSOMALE
RNA
.
53
2.4.2
AO.9
UND
DAS
LANGZEITWACHSTUM
NACH
A-FAKTOR-GABE
.
54
2.4.3
OFFENE
FRAGEN
.
55
23
AL.4
.
55
2.5.1
AL.4
KODIERT
EIN
HITZESCHOCKPROTEIN
.
56
2.5.2
HOMOLOGE
GENE
.
57
2.5.3
A-FAKTOR-BEDINGTE
GENABSCHALTUNG
UND
FUNKTION
.
58
2.6
A2.S
.
59
2.7
A3.5
.
59
INHALTSVERZEICHNIS
3.
EXISTENZ
UND
FUNKTION
A-FAKTOR-ABGESCHALTETER
GENE
.
61
3.1
EXISTENZ
A-FAKTOR-ABGESCHALTETER
GENE
.
61
3.2
GENABSCHALTUNG
DURCH
A-FAKTOR,
N-GLYKOSYLIERUNG
UND
ZELLZYKLUSARREST
.
62
3.3
FUNKTION
A-FAKTOR-BEDINGTER
GENABSCHALTUNGEN
.
63
IV
ZUSAMMENFASSUNG
.
64
V
MATERIAL
UND
METHODEN
.
66
1.
MATERIAL
.
66
1.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
66
1.2
VERBRAUCHSMATERIAL
.
66
1.3
GERAETE
.
67
1.4
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
67
1.5
MEDIEN
.
68
1.5.1
MEDIEN
FUER
E.
COLI
.
68
1.5.2
MEDIEN
FUER
S.
CEREVISTAE
.
69
1.6
ORGANISMEN
.
69
1.6.1
BAKTERIENSTAEMME
.
69
1.6.2
HEFESTAEMME
.
70
1.7
VEKTOREN
.
70
1.8
GENBANK
.
71
2.
METHODEN
.
71
2.1
ZELLKULTUREN
.
71
2.1.1
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
.
71
2.1.2
ANZUCHT
VON
HEFEZELLEN
.
71
2.1.3
DAUERKULTUREN
.
71
2.1.4
INDUKTION
VON
MDTG-ZELLEN
MIT
A-FAKTOR
.
71
2.1.5
WACHSTUMSMESSUNGEN
.
71
2.2
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
71
2.2.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
HEFEZELLEN
.
71
2.2.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
.
72
2.2.2.1
MINIPRAEPARATION
NACH
BIRNBOIM
UND
DOLY
.
72
2.2.2.2
STET-MINIPRAEPARATION
.
72
2.2.2.3
CAESIUMCHLORID-GRADIENTEN-PRAEPARATION
.
72
2.2.3
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFEZELLEN
.
72
2.2.3.1
MOERSER-METHODE
.
72
2.2.3.2
HOT-PHENOL-METHODE
.
73
2.2.3.3
KOMBINIERTE
METHODE
ZUR
RNA-ISOLIERUNG
.
73
2.2.4
ANREICHERUNG
VON
POLY(A)
+
-RNA
.
73
23
BEARBEITUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
73
2.3.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
73
2.3.2
HERSTELLUNG
GLATTER
DNA-ENDEN
.
73
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
74
2.3.4
KINASIERUNG
VON
LINKEM
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
.
74
2.3.5
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
74
2.3.6
PROTEASE
K-VERDAU
.
74
2.3.7
REINIGUNG
VON
DNA
.
74
2.3.7.1
PHENOLISIERUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNA
.
74
2.3.7.2
DNA-REINIGUNG
UEBER
GENECLEAN
.
74
YY
2.3.8
KONZENTRATIONS
UND
REINHEITSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
74
2.4
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
75
2.4.1
AGAROSEGELELEKROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
75
2.4.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-GELEN
.
75
2.4.2.1
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-AGAROSEGELSTUECKEN
MIT
PHENOL
.
75
2.4.2.2
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELSTUECKEN
MIT
GENECLEAN
.
75
2.4.3
GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
RNA
.
75
23
NUKLEINSAEURENTRANSFER,
MARKIERUNG,
HYBRIDISIERUNG
.
75
2.5.1
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
NITROCELLULOSEFILTER
.
75
2.5.1.1
SOUTHERN
BLOT
.
75
2.5.1.2
NORTHERN
BLOT
.
75
2.5.1.3
DNA-TRANSFER
VON
AGTLO-PLAQUES
.
76
2.5.1.4
DNA-TRANSFER
VON
BAKTERIENKOLONIEN
.
76
2.5.1.5
DOTBLOT
.
76
2.5.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
76
2.5.2.1
SYNTHESE
RADIOAKTIVER
ERSTSTRANG-CDNA
.
76
2.5.2.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
76
2.S.2.3
ABTRENNUNG
NICHT
EINGEBAUTER
NUKLEOTIDE
UEBER
EINE
SPIN
COLUMN
.
76
2.5.3
HYBRIDISIERUNG
.
76
2.5.3.1
PLAQUE-DNA-HYBRIDISIERUNG
MIT
MARKIERTER
ERSTSTRANG-CDNA
.
76
2.5.3.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
MARKIERTEN
DNA-FRAGMENTEN
.
77
2.5.3.3
AUTORADIOGRAPHIE
.
77
2.5.3.4
ABWASCHEN
HYBRIDISIERTER
DNA
("STRIPPEN")
.
77
2.5.4
NICHTRADIOAKTIVE
MARKIERUNG
UND
HYBRIDISIERUNG
.
77
2.6
DNA-SEQUENZANALYSE
.
77
2.6.1
SEQUENZIEREN
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
.
77
2.6.2
DATENVERARBEITUNG
DER
DNA-SEQUENZEN
.
77
2.7
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
PCR
.
78
2.8
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
78
2.8.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
78
2.8.1.1
CALCIUMCHLORID-METHODE
.
78
2.8.1.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
NACH
HANAHAN
.
78
2.8.1.3
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
NACH
AMERSHAM
.
78
2.8.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COFI-ZDLEN
.
79
2.8.3
TRANSFORMATION
MIT
M13MPL8-DNA
.
79
2.9
TRANSFORMATION
VON
HEFEZELLEN
.
79
2.9.1
TRANSFORMATION
MODIFIZIERT
NACH
ITO
ET
AL
.
79
2.9.2
TRANSFORMATION
NACH
GIETZ
ET
AL
.
79
INHALTSVERZEICHNIS
2.10
SPORULATION
UND
TETRADENANALYSE
.
79
2.10.1
SPORULATION
VON
HEFEZELLEN
.
79
2.10.2
TETRADENANALYSE
.
80
2.11
KONSTRUKTION
EINER
CDNA-GENBANK
.
80
2.11.1
ERSTSTRANGREAKTION
.
80
2.11.2
ZWEITSTRANGREAKTION
.
80
2.11.3
BESTIMMUNG
DER
AUSBEUTE
.
80
2.11.4
GLAETTEN
DER
UEBERSTEHENDEN
CDNA-ENDEN
.
80
2.11.5
METHYLIERUNG
DER
CDNA
.
80
2.11.6
ANLIGIEREN
VON
ECORI-SCHNITTSTELLEN
.
81
2.11.6.1
LIGATION
VON
ECORI-LINKEM
.
81
2.11.6.2
LIGATION
VON
ECORI-ADAPTEM
.
81
2.11.7
REINIGUNG
DER
CDNA
UEBER
EINE
SEPHADEX-CL-4B-SAEULE
.
81
2.11.8
GROESSENSELEKTIONIERUNG
DER
CDNA
.
81
2.11.9
LIGATION
DER
CDNA
IN
AGTLO
.
81
2.11.10
IN
VITRO-VERPACKUNG
VON
A-DNA
.
81
2.11.10.1
PRAEPARATION
DER
VERPACKUNGSEXTRAKTE
.
81
2.11.10.2
VERPACKUNGSREAKTION
.
82
2.11.11
TITERBESTMUNUNG
.
82
2.11.12
AMPLIFIZIERUNG
DER
GENBANK
.
82
2.12
DIFFERENTIELLES
SCREENING,
ISOLIERUNG
VON
AE-DNA,
SUBKLONIERUNG
VON
INSERTS
.
82
2.12.1
DIFFERENTIELLES
SCREENING,
ERSTE
RUNDE
.
82
2.12.2
ZWEITE
DIFFERENTIELLE
SCREENING-RUNDE
.
82
2.12.3
ISOLIERUNG
VON
A-DNA
AUS
PHAGENLYSATEN
.
83
2.12.4
SUBKLONIERUNG
VON
AGTLO-INSERTS
IN
PUC18
.
83
2.13
PROTEINISOLIERUNG
.
83
2.13.1
PROTEINEXTRAKTION
AUS
HEFEZELLEN
.
83
2.13.2
PROTEINFRAKTIONIERUNG
.
83
2.13.3
PROTEINHES
TIMMUNG
NACH
LOWRY
ET
AL
.
83
2.14
ANTIKOERPERGEWINNUNG
.
83
2.14.1
SERUMGEWINNUNG
.
83
2.14.2
ANTIKOERPERISOLIERUNG
DURCH
PRAEADSORPTION
UND
AFFMITAETSREINIGUNG
.
84
2.15
AUFTRENNUNG
UND
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
.
84
2.15.1
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
84
2.15.2
WESTERN
BLOT
.
84
2.15.3
PROTEIN-DOT
BLOT
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2.15.4
IMMUNOBLOT
MIT
PEROXIDASE
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VI
LITERATURVERZEICHNIS
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