Identifizierung eines perizytären Blut-Hirn-Schranken-spezifischen Antigens und experimentelle Untersuchungen zu seiner Expression unter normalen und pathologischen Bedingungen im ZNS der Ratte:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
.
I
1
,)
DIE
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
1
1.1.)
HOMOEOSTASE
UND
INNERES
MILIEU
.
1
1.2.)
HISTORISCHER
RUECKBLICK
.
1
1.3.)
DAS
MODERNE
KONZEPT
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
2
1.3.1.)
DAS
ENDOTHEL
ZEREBRALER
KAPILLAREN
.
3
1.3.2.)
PERIZYTEN
UND
IHRE
RELEVANZ
IHR
DIE
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
8
1.3.3.)DIE
BASALMEMBRAN
.
10
1.3.4.)
INDUKTION
ENDOTHELIALER
BLUT-HIM-SCHRANKEN-SPEZIFISCHER
EIGENSCHAFTEN:
DIE
FUNKTION
DER
ASTROZYTEN
.
11
1.3.5.)MODIFIZIERUNGEN
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
12
2.)
PIE
BLUT-HIM-SCHRANKE
IN
VITRO
.
13
3
.^
PATHOLOGISCHE
VERAENDERUNGEN
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
14
4.)
EXPERIMENTELLE
FRAGESTELLUNG
.
16
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
1.)
ANTIKOERPER
.
18
1.1.)
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.
18
1.2.)
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
19
2.)
HISTOCHEMISCHE
ARBEITSMETHODEN
.
20
2.1.)
LICHTMIKROSKOPISCHE
TECHNIKEN
.
20
2.1.1.)
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ-METHODE
.
20
2.1.2.)
RASTER-LASER-MIKROSKOPIE
UND
DREIDIMENSIONALE
DARSTELLUNG
IMMUNHISTOCHEMISCHER
MARKIERUNGEN
.
20
2.1.3.)
TOLUIDINBLAU
FAERBUNG
.
21
2.1.4.)LICHTMIKROSKOPIE
VON
INLR-WHITE
EINGEBETTETEN
SEMIDUENNSCHNITTEN
.
21
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.)
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
TECHNIKEN
(EM)
.
21
2.2.1.)
EINBETTUNGSVERFAEHREN
FUER
DIE
TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
21
2.2.1.1.)
LR-WHITE
EINBETTUNG
.
21
2.2.I.2.)
GEWEBEEINBETTUNG
INEPON
(LUFT,
1961)
.
22
2.2.2.)
IMMUNOLOGISCHE
MATKIENMGSTECHNIKEN
FUER
DIE
TRANSMISSIONS
UND
RASTER-ELEKTRONENMIKROSKOPIE.
22
2.2.2.I.)
IMMUNMARKIERUNG
AN
LAE-W7IUEE-SCHNITTEN
.
22
2.2.2.2.)
7 E-EMFTE *FING"-IMMUNO-GOID-MARKIERUNG.
23
22.2.3.)
IMMUNOLOGISCHE
MARKIENMGSTECHNIK
FUER
DIE
RASTER-IMMUNO-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
23
2.2.3.)
TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
(TEM)
.
24
2.2.4.)
TRANSMISSIONS-IMMUNO-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
(T1EM)
.24
2.2.5.)RASTER-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
(REM)
.24
2.2.6.)
RASTER-IMMUNO-EIEKTRONENMIKROSKOPIE
(RIEM)
.
!
.
25
3.)
BIOCHEMISCHE
ARBEITSMETHODEN
.
26
3.1.)
GEWEBEPRAEPARATIONEN
FUER
BIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
26
3.1.1.)
ISOLIERUNG
VON
RENALEN
BUERSTENSAUMPROTEINEN
(BIBER
ET
AL.,
1981)
.
26
3.1.2.)
ISOLIERUNG
VON
ZEREBRALEN
MIKROGEFAESSEN
(MRSULJA
ET
AL.,
1976)
.
26
3.1.3.)
ISOLIERUNG
VON
ZEREBRALEN
MIKROVASKULAEREN
ZELLEN
AUS
DER
RATTE
.
26
3.2.)
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
27
3.2.1.)
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
27
3.2.1.1.)
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
.
27
3.2.I.2.)
POLYACRYLAMIDGELE
UND
ELEKTROPHORESE
.
27
3.2.1.3.)
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
UND
2D-PAGE
.
28
3.2.2.)
ELEKTROTRANSFER
AUF
POLYVINYLDIFLUORID
MEMBRANEN
(WESTERN
TRANSFER)
.
28
3.3.)
IMMUNINKUBATION
ELEKTROTRANSFERIERTER
PROTEINE
.
29
3.4.)
MIKROSEQUENZIERUNG
NACH
EDMAN
.
29
3.4.1.)
ELEKTROBLOTS
FUER
DIE
MIKROSEQUENZIERUNG
.
30
3.4.2.)
N-TERMINALE
SEQUENZANALYSE.30
3.4.3.)
SEQUENZVERGLEICH
.30
4.)
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITSMETHODEN
.
31
4.1.)
REVERSE-TRANSCRIPTASE
POLYMERASE-CHAIN-REACTION
(RT-PCR)
.
31
4.1.1.)
ISOLIERUNG
VON
TOTAL-RNA
(MODIFIZIERT
NACH
CHOMCZYNSKI
UND
SACCHI,
1987)
.
31
4.1.2.)
RT-PCR
AN
TOTAL-RNA
AUS
ZEREBRALEN
MIKROVASKULAEREN
ZELLEN
DER
RATTE
.
32
4.1.3.)
ELEKTROPHORETISCHE
ANALYSE
DES
CDNA-PRODUKTS
AUS
DER
RT-PCR
.
32
4.1.4.)
REINIGUNG
DER
RT-PCR-CDNA
.
33
4.2.)
SEQUENZIERUNG
DES
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
ERHALTENEN
CDNA-FRAGMENTS
.
33
4.2.1.)
SUBKLONIERUNG
DES
RT-PCR-CDNA-FRAGMENTS
IN
DAS
PLASMID
PGEM
3
Z
.
33
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.2.1.1.)
VORBEREITUNG
DES
CDNA-FRAGMENTS
.
33
4.2.1.2.)
VORBEREITUNG
DES
PLASMIDS
PGEM
3
Z
.
33
4.2.I.3.)
LIGATION.
.
34
4.2.2.)
TRANSFORMATION
DES
VEKTORS
IN
ESCHERICHIA
COLI
IM
109
UND
AMPLIFIKATION
.
34
4.2.2.1.)
PRAEPARATION
KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN
.
34
4.2.2.2.)
TRANSFORMATION
UND
SELEKTION
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
.
35
4.2.3.)
PLASMIDISOLIERUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
CDNA-INSERTS
.36
4.2.3.1.)
PLASMIDISOLIERUNG
.36
4.2.3.2.)
NACHWEIS
DES
CDNA-INSERTS
IM
PLASMID
PGEM
3
Z
.37
4.2.4.)
SEQUENZIERUNG
DER
RT-PCR-PROPAGIERTEN
CDNA
.
37
4.3.)
NORTHEMBLOT-ANALYSE
.
38
4.4.)
SOUTHEMBLOT-ANALYSE
.
39
5.
)
KULTIVIERUNG
VON
PERIZYTEN
UND
IN
VITRO
EXPRESSION
DER
PERIZYTAEREN
AMINOPEPTIDASE
N
FPAPN)
.
40
5.1.)
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
ZEREBRALEN
MIKROVASKULAEREN
ZELLEN
.
40
5.1.1.)
ENDOTHELZELL
UND
PERIZYTEN-KULTUNNEDIUM
.
40
5.I.I.I.)
RETINAEXTRAKT
ALS
MEDIUM-ADDITIVUM
.
40
5.1.1.2.)
RAT-BRAIN-ENDOTHELIUM
(RBE)
MEDIUM
.
40
5.1.2.)
SUBSTRATE
ZUR
KULTIVIERUNG
VON
ZEREBRALEN
PERIZYTEN
(UND
ENDOTHELZELLEN)
.
41
5.1.3.)
ISOLIERUNG
VON
ENDOTHELZELLEN,
PERIZYTEN
UND
KAPILLARFRAGMENTEN
AUS
RATTENHIM
(RISAU
ET
AL.,
1992)
.
41
5.1.4.)
MIKROVASKULAERE
PRIMAERKULTUREN
.
42
5.1.5.)
MORPHOLOGISCHE
BETRACHTUNGEN
DER
KULTIVIERTEN
ZELLEN
(LM
UND
REM)
.
43
5.1.6.)
UNTERSUCHUNG
DER
PAP
N
EXPRESSION
IN
VITRO
.
43
5.1.7.)
CHEMISCHER
NACHWEIS
DER
AMINOPEPTIDASE-AKTIVITAET
IN
VITRO
.
43
5.1.8.)
NACHWEIS
DER
PAP
N
MESSENGER-RNA
IN
LANGZEITKULTUREN
.
44
5.1.9.)
NACHWEIS
DIVERSER
MARKERPROTEINE
IN
LANGZEITKULTUREN
.
45
5.2.)
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
ASTROZYTEN
.
45
5.2.1.)
ASTROZYTEN-KULTUNNEDIUM
.
45
5.2.2.)
ISOLIERUNG
VON
ASTROZYTEN
AUS
RATTENHIRN
.
45
5.2.3.)
ASTROZYTEN-KULTIVIERUNG
.
46
5.3.)
KOKULTUREN
VON
PERIZYTEN
UND
ASTROZYTEN
.
46
5.3.1.)
KULTURMEDIUM
.
46
5.3.2.)
KOKULTIVIERUNG
MIT
DIREKTEM
PERIZYTEN-ASTROZYTEN-KONTAKT
.
46
5.3.2.I.)
KULTURBEDINGUNGEN
.
46
5.3.2.2.)
KOPPLUNGSVERSUCHE
NACH
DER
" FYE-COUP/RNG
"
-METHODE
.
47
5.3.3.)
KOKULTIVIERUNG
MIT
PERIZYTEN-ASTROZYTEN-KONTAKT
AUF
POLYCARBONATMEMBRANEN
.
47
5.3.4.)
KOKULTIVIERUNG
VON
PERIZYTEN
UND
ASTROZYTEN
OHNE
DIREKTEN
ZELL-ZELL-KONTAKT
.48
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.)
KONTROLLVERSUCHE
ZUR
ASTROZYTAEREN
PAP
N-INDUKTION
.
48
5.4.1.)
KULTIVIERUNG
VON
MDCK-ZELLEN
.
48
5.4.2.)
KOKULTIVIERUNG
VON
PERIZYTEN
UND
MDCK-ZELLEN
.
49
6.)
EXPRESSION
DER
D
AP
N
UNTER
PATHOLOGISCHEN
VERAENDERUNGEN
DER
BLUT-HIM
SCHRANKE
-
EXPERIMENTELLE
AUTOIMMUN
ENZEPHALOMYELITIS
(EAE)
.
50
6.1.)
AKUTE
EXPERIMENTELLE
AUTOIMMUN
ENZEPHALOMYELITIS
-
INDUKTION
UND
PATHOGENESE
.
50
6.1.1.)
ETABLIERUNG
SPEZIFISCHER
T-ZELL-LINIEN
GEGEN
DAS
BASISCHE
MYELINPROTEIN
.
50
6.1.2.)
INDUKTION
DER
AKUTEN
EAE
UND
KLINISCHE
BEOBACHTUNG
.
52
6.1.3.)
MIKROSKOPISCHE
VERIFIZIERUNG
DES
KLINISCHEN
VERLAUFS
DER
AKUTEN
EAE
.
52
6.2.)
EXPRESSIONSMUSTER
DER
PAP
N
UND
INFLAMMATORISCHER
MARKER-MOLEKUELE
.
53
6.2.1.)
UNTERSUCHUNG
DES
EXPRESSIONSMUSTERS
DER
PAP
N
IM
VERLAUF
DER
AKUTEN
EAE
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
GEFAESS-ASSOZIIERTEN
PAP
N
EXPRESSSION
.
53
6.2.2.)
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
ANDERER
MARKER-MOLKUELE
BEI
AKUTER
EAE
.
53
6.3.)
IN
VITRO
VERSUCHE
ZUR
EAE
.
54
6.3.1.)
KOKULTUREN
VON
PERIZYTEN,
ASTROZYTEN
UND
MBP-STIMULIERTEN
T-LYMPHOZYTEN
.
54
6.3.2.)KOKULTUREN
ZEREBRALER
MIKROVASKULAERER
ZELLEN
UND
MBP-STIMULIERTER
T-LYMPHOZYTEN
MIT
GEWEBESCHNITTEN
VOM
GEHIRN
DER
RATTE
.54
III.
BEFUNDBERICHT
.
56
L.L
LMMUNZVTOCHEMISCHE
LOKALISATION
DES
"140
KDA-ANTIGENS"
.
56
1.1.)
LICHTMIKROSKOPISCHE
LOKALISATION
DES
"
140
KDA-ANTIGENS"
.
56
1.1.1.)
VORKOMMEN
UND
LOKALISATION
IN
PERIPHEREN
ORGANEN
UND
IM
ZNS
.
56
1.1.2)
DREIDIMENSIONALE
DARSTELLUNG
DER
"140
KDA-ANTIGEN"
EXPRESSION
EINER
ZEREBRALEN
KAPILLARE
.
62
1.1.3.)LOKALISATION
DES
"140
KDA-ANTIGENS"
IN
VITRO
.
66
1.2.)
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
LOKALISATION
DES
"
140
KDA-ANTIGENS"
.67
1.2.1.)
LOKALISATION
AN
ALVEOLARZELLEN
TYP
II
DER
LUNGE
UND
ENTEROZYTEN
DES
DUENNDARMS
.
67
1.2.2.)
LOKALISATION
AN
ZEREBRALEN
PERIZYTEN
IN
VITRO
-
TIEM-STUDIEN
.
69
1.2.3.)
LOKALISATION
AN
ZEREBRALEN
PERIZYTEN
IN
VITRO
-
RIEM-STUDIEN
.
71
2.)
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
IDENTIFIZIERUNG
DES
"140
KDA-ANTIGENS"
.
74
2.1.)
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
.
74
2.1.1.)
IMMUNO-WESTERRIBLOT-ANALYSE
.
74
2.1.2.)N-TERMINALEMIKROSEQUENZIERUNG
NACH
EDMAN
.
76
INHALTSVERZEICHNIS
V
2.2.)
MOLEKULARBIOLOGISCHE
IDENTIFIZIERUNG
.
77
2.2.1.)RT-PCRUND
SEQUENZIERUNG
.
77
2.2.2.)
NORTHEMBLOT-ANALYSE
.
77
3
^
KULTIVIERUNG
ZEREBRALER
MIKROVASKULAERER
ZELLEN
.
79
3.1.)
PERIZYTEN-UND
ENDOTHELZELL-PRIMAERKULTUREN
.
79
3.1.1.)
CHARAKTERISIERUNG
DER
KULTIVIERTEN
ZELLTYPEN
.
79
3.1.1.1.)
MORPHOLOGIE
UND
WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN
.
79
3.1.1.2.)
EXPRESSION
VERSCHIEDENER
MARKERPROTEINE
.
82
3.1.2.)
ZYTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
AMINOPEPTIDASE
AKTIVITAET
.
85
3.1.3.)
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REGULATION
DER
PAP
N
EXPRESSION
IN
VITRO
.
86
3.2.)
REKULTIVIERUNG
MIT
ASTROZYTEN
.
87
3.2.1.)
REKULTIVIERUNG
MIT
DIREKTEM
ZELL-ZELL-RONTAKT
.
87
3.2.2.)
REKULTIVIERUNG
MIT
LIMITIERTEM
ZELL-ZELL-KONTAKT
.
88
3.2.3.)
REKULTIVIERUNG
OHNE
ZELL-ZELL-KONTAKT
.
88
3.2.4.)
UNTERSUCHUNG
DER
PERIZYTEN-ASTROZYTEN-ROPPLUNG
VIA
GAP
JUNCTIONS
.
92
4.)
EXPRESSION
DER
PAP
N
BAE
PATHOLOGISCHEN
VERAENDERUNGEN
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
-
EXPERIMENTELLE
AUTOIMMUN
ENZEPHALOMYELITIS
(EAE)
.
95
4.1.)
EXPRESSIONSMUSTER
DER
PAP
N
WAEHREND
DER
AKUTEN
EAE
.
95
4.1.1.)
PATHOGENESE
DER
AKUTEN
EAE
.
95
4.1.2.)
EXPRESSION
DER
PAP
N
WAEHREND
DER
AKUTEN
EAE
IM
BEREICH
DES
LUMBALEN
RUECKENMARKS
.
97
4.1.2.1.)
HERABREGULATION
DER
GEFAESS-ASSOZIIERTEN
PAP
N
EXPRESSION
.
97
4.1.2.2.)
DIE
PAP
N
EXPRESSION
PARENCHYMATOESER
EINZELZELLEN
AM
6.
TAG
DER
AKUTEN
EAE
.
101
4.1.2.3.)
CHARAKTERISIERUNG
DER
PARENCHYMATOESEN
EINZELZELLEN
.
108
4.1.3.)
EXPRESSION
DER
PAP
N
WAEHREND
DER
AKUTEN
EAE
IN
RLEIN
UND
GROSSHIRN
.
111
4.1.4.)
RORRELATION
DER
VERMINDERTEN
GEFAESS-ASSOZIIERTEN
PAP
N
EXPRESSION
MIT
EINER
ERHOEHTEN
PERMEABILITAET
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
111
4.2.)
VERSUCHE
ZU
EINEM
MODELL
DER
EAE
IN
VITRO
.
113
4.2.1.)
REDUKTION
DES
EAE-MODELLS
AUF
KOKULTUREN
VON
PERIZYTEN,
ASTROZYTEN
UND
MBP-STIMULIERTEN
T-LYMPHOZYTEN
.
113
4.2.2.)
IN
V/IRO-EAE-MODELL
AN
GEWEBESCHNITTEN
DES
GEHIRNS
.
114
VI
INHALTSVERZEICHNIS
IV.
DISKUSSION
.
116
L.)
DAS
"140
KDA-ANTIGEN"
BLUT-HIM-SCHRANKEN-ASSOZIIERTER
PERIZYTEN
IST
IDENTISCH
MIT
DER
AMINOPEPTIDASE
N
.
116
1.1.)
LOKALISATION
DES
"140
KDA-ANTIGENS"
.
116
1.2.)
IDENTIFIZIERUNG
DES
"140
KDA-ANTIGENS*
.
117
1.3.)
PERIZYTEN
UND
DIE
BLUT-HIRN-SCHRANKE:
EIN
"CHECKPOINT
"
DES
NEUROPEPTID-TRANSPORTS?
.
118
2.)
DIE
PERIZYTAERE
AP
N
UNTERLIEGT
IN
VITRO
EINEM
ASTROZYTAEREN
INDUKTIONSMECHANISMUS
.
121
2.1.)
DIE
KULTIVIERUNG
ZEREBRALER
MIKROVASKULAERER
ZELLEN
.
121
2.2.)
DIE
KOKULTIVIERUNG
ZEREBRALER
MIKROVASKULAERER
ZELLEN
MIT
ASTROZYTEN
.
123
3.)
PAP
N
EXPRESSION
UND
"EXPERIMENTELLE
AUTOIMMUN
ENZEPHALOMYELITIS"
-
PERIZYTEN,
EIN
POOL
PERIVASKULAERER
MAKROPHAGEN?
.
125
3.1.)
HERABREGULATION
DER
GEFAESS-ASSOZIERTEN
PAP
N
EXPRESSION
-
KORRELATION
MIT
FOKALEN
STOERUNGEN
DER
BLUT-HIM-SCHRANKE
.
125
3.2.
EXPRESSION
DER
PAP
N
DURCH
INVASIVE
INFLAMMATORISCHE
ZELLEN:
MIKROGLIAZELLEN,
MAKROPHAGEN
UND
PERIZYTEN
ALS
SYNERGISTISCH
AGIERENDE
"SCAVENGER
CELLS
"
DES
ZNS?
.
127
V.
ZUSAMMENFASSUNG
.
133
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
.
135
VII.
ABBILDUNGSVERZEICH
NIS
.
154 |
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