Charakterisierung von mRNAs sekretorischer Proteine der bovinen Bläschendrüse:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
7
2.1
SPEKTROSKOPISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
7
2.2
EINSATZ
VON
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
(DAVIS
ET
AL.,
1980;
ROBERTS,
1985)
.
7
2.3
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
.
7
2.4
PHENOL-EXTRAKTION
.
8
2.5
ALKOHOLISCHE
FAELLUNG
VON
DNA
.
8
2.5.1
FAELLUNG
MIT
NATRIUMACETAT
.
8
2.5.2
FAELLUNG
MIT
AMMONIUMACETAT
.
8
2.5.3
FAELLUNG
MIT
ISOPROPANOL
.
9
2.6
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
9
2.7
LIGATION
.
9
2.8
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI-ZEUEN
.
10
2.8.1
JM109-ZELLEN
.
10
2.9
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI-TJAEIEA
MIT
PUCL
8
(SIEHE
2.64)
.
10
2.10
GLYCERINKULTUREN
.
11
2.11
AUTORADIOGRAPHIE
.
11
2.12
ANALYTISCHE
BIS
HALBPRAEPARATIVE
PLASMIDAUFARBEITUNG
(LEE
UND
RASHEED,
1990)
.
11
2.13
ANALYTISCHE
BIS
HALBPRAEPARATIVE
PHAGEN
DNA-AUFARBEITUNG
(PLATTEN
LYSAT
METHODE)
.
12
2.13.1
VORBEREITUNG
DER
DEAE-ZELLULOSE
.
12
2.13.2
ISOLIERUNG
DER
PHAGEN
DNA
.
13
2.14
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
BLUT
(JOHN
ET
AL.,
1991)
.
13
2.15
5'-TERMINAIE
MARKIERUNG
VON
DESOXYOLIGONUKLEOTIDEN
DURCH
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
(CHACONAS
UND
SANDE,
1980)
.
14
2.16
OLIGONUKLEOTID-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
(FEINBERG
UND
VOGELSTEIN,
1984)
.
15
2.17
BESTIMMUNG
DES
EINBAUS
RADIOAKTIVER
DESOXYRIBONUKLEOTIDE
IN
DNA
DURCH
PAPIERCHROMATOGRAPHIE
.
16
2.18
CDNA-SYNTHESE
AUS
POLYA(
+
)
RNA
DER
BOVINEN
BLAESCHENDRUESE
(GUBLER
UND
HOFMANN,
1983)
.
16
2.18.1
ERSTSTRANGSYNTHESE
.
16
2.18.2
ZWEITSTRANGSYNTHESE
.
17
2.18.3
BERECHNUNG
DER
ERSTSTRANG
UND
ZWEITSTRANGSYNTHESE
.
17
2.19
ANALYSE
DER
CDN
A-SYNTHESE
DURCH
ALKALISCHE
GELELEKTROPHORESE
.
18
2.20
AUFFUELLUNG
VON
5'-UEBERHAENGEN
MIT
T4-DNA-POLYMERASE
.
19
2.21
KLONIERUNG
DER
CDNA-FRAGMENTE
.
19
2.21.1
LIGIEREN
DER
POLYLINKER
UND
GELCHROMATOGRAPHIE
.
20
2.21.2
LIGATION
DER
CDNA
IN
DIE
PHAGENARME
UND
VERPACKUNG
DER
PHAGEN
DNA
.
20
2.22
ANZUCHT
VON
E.
COLI
Y1090
.
20
2.23
PLATTIEREN
DER
XGT
1
1-PHAGEN
.
21
2.24
DURCHMUSTERUNG
DER
X.GTL
1
-BIBLIOTHEK
.
21
2.24.1
HERSTELLUNG
DER
REPLIKAFILTER
.
21
2.24.2
IMMUNREAKTION
.
21
2.24.3
VEREINZELUNG
DER
PHAGEN
.
22
2.25
DURCHMUSTERUNG
EINER
COSMID-BIBLIOTHEK
DURCH
KOLONIE
HYBRIDISIERUNG
.
23
2.25.1
PLATTIEREN
DER
BOVINEN
COSMID-BIBLIOTHEK
UND
HERSTELLUNG
DER
REPLIKAFILTER
.
23
2.25.2
EINFRIEREN
DER
ORIGINALFILTER
.
23
2.25.3
LYSE
DER
BAKTERIEN,
DENATURIERUNG
UND
DNA-FIXIERUNG
.
24
2.25.4
HYBRIDISIERUNG
DER
FILTER
.
24
2.26
DNA-SYNTHESE
.
24
2.26.1
SYNTHESEREAKTION
.
24
2.26.2
ABSPALTUNG
VOM
TRAEGER
UND
ABSPALTUNG
DER
SCHUTZGRUPPEN
.
24
2.26.3
AUFREINIGUNG
.
25
2.27
DOPPELSTRANG-SEQUENZIERUNG
VON
DNA
(SANGER
ET
AL.,
1977)
.
25
2.28
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
ZUR
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
(GAROFF
UND
ANSORGE,
1981;
ANSORGE
UND
LABEIT,
1984;
OLSSON
ET
AL.,
1984)
.
26
2.29
WALKING
PRIMER
STRATEGIE
.
27
2.30
NESTED
DELETION-STRATEGIE
(HENKOFF,
1984)
.
28
2.30.
1
NESTED
DELETION
I
.
28
2.30.1.1
AUSWAHL
DER
RESTRIKTIONSENZYME
.
28
2.30.1.2
VERKUERZUNG
DER
PLASMIDE
DURCH
EXONUKLEASE
HI
(EXOHI-)
UND
S1
NUKLEASE-REAKTION
.
28
2.30.2
NESTED
DELETION
II
.
29
2.31
COMPUTER-ANALYSE
VON
DNA-SEQUENZEN
.
29
2.32
SOUTHERN
BLOT
.
29
2.33
HYBRIDISIERUNGEN
VON
SOUTHERN
UND
NORTHEM
BLOT'S
(CHURCH
UND
GILBERT,
1984)
.
30
2.34
ARBEITEN
MIT
RNA
.
31
2.35
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
NACH
KEMME
ET
AL.
(1986)
.
31
2.36
ISOLIERUNG
VON
RNA
DURCH
ULTRAZENTRIFUGATION
(CHIRGWIN
ET
AL.,
1979)
.
33
2.37
FORMALDEHYD-AGAROSE-GELELEFAROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
RNA
(LEHRACH
ET
AL.,
1977).
34
2.38
FAERBUNG
VON
RNA
DURCH
ACRIDINARANGE
(WILKINSON
ET
AL.,
1990)
.
34
2.39
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
(ALWINE
ET
AL.,
1977)
.
35
2.40
HYBRIDISIERUNG
VON
NORTHEM
BLOT
'
S
(KHANDUAN,
1986)
.
35
2.41
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
DURCH
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
(SAIKI
ET
AL.,
1988)
.
.
36
2.42
HERSTELLUNG
EINES
T-VEKTORS
(MARCHUK
ET
AL.,
1991)
.
37
2.43
GEWINNUNG
VON
GEWEBEN
AUS
DEM
GESCHLECHTSTRAKT
DES
BULLEN
.
38
2.44
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
NACH
LAEMMLI
(1970)
.
38
2.45
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
R250-FAERBUNG
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
40
2.46
IMMUNOBLOT
NACH
KYHSE-ANDERSEN
(1984)
.
40
2.47
"COLAURION'-FAERBUNG
(PROTEINFAERBUNG)
.
41
2.48
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF
MEMBRANEN
.
42
2.49
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
MIT
DEAE-SEPHADEX
A-25
.
42
2.50
FAST
PROTEIN
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(FPLC)
.
43
2.51
AMINOSAEURENANALYSE
.
43
2.52
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
DURCH
AUTOMATISIERTEN
EDMANN-ABBAU
.
44
2.53
HERSTELLUNG
EINES
KANINCHEN-ANTISERUMS
GEGEN
DAS
SAURE
14KDA-PROTEIN
.
44
2.54
ENZYME LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.
45
2.55
KOPPLUNG
VON
PROTEINEN
AN
BRCN-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
46
2.56
ISOLIERUNG
SPEZIFISCHER
IGGS
.
46
2.57
ISOLIERUNG
VON
PERIPHEREN
MONONUKLEAEREN
LEUKOZYTEN
(PMNLS)
.
47
2.58
MATERIALIEN
.
48
2.59
ALLGEMEINE
METHODEN
UND
GERAETE
.
50
2.60
PUFFER
.
51
2.61
MEDIEN
.
52
2.62
BAKTERIENSTAEMME
.
53
2.63
PHAGEN
.
53
2.64
VEKTOREN
.
54
2.65
WEITERES
.
54
3.
ERGEBNISSE
.
55
3.1
HERSTELLUNG
EINER
CDNA-EXPRESSIONSBIBLIOTHEK
AUS
DER
BLAESCHENDRUESE
DES
BULLEN
.
55
3.1.1
CDNA-SYNTHESE
.
55
3.1.2
KLONIERUNG
DER
CDNA
.
57
3.2
CHARAKTERISIERUNG
SPEZIFISCHER
MRNAS
VON
P6,
EINEM
BASISCHEN
HAUPTPROTEIN
DES
BOVINEN
SAMENPLASTNAS
.
59
3.2.1
DURCHMUSTERUNG
DER
CDNA-BIBLIOTHEK
SVS2B
MIT
ANTI-P6-IGGS
.
59
3.2.2
BESTIMMUNG
DER
FRAGMENTLAENGEN
DER
CDNA-KLONE
.
59
3.2.3
UMKLONIERUNG
DER
CDNA-IZISERTS
.
60
3.2.4
SEQUENZVERGLEICH
DER
CDNA-KLONE
.
61
3.2.5
SEQUENZIERUNG
DES
P6-SPEZIFISCHEN
KLONS
PH42
.
62
3.2.6
ANALYSE
DER
CDNA-SEQUENZ
VON
PH42
.
.
.
64
3.2.7
SEQUENZVERGLEICH
MIT
DER
DATENBANK
GENEMBL
.
64
3.2.8
SEQUENZVERGLEICH
DES
VON
PH42
ABGELEITETEN
PROTEINS
MIT
DER
HUMANEN
MCP
1
-PRAEFORM
.
66
3.2.9
SEQUENZVERGLEICH
VON
P6
MIT
DER
DATENBANK
SWISSPROT
.
67
3.2.10
DAS
PROTEIN
P6
.
68
3.2.11
NACHWEIS
DER
P6-MRNA
IN
DER
BLAESCHENDRUESE
DES
BULLEN
.
70
3.2.12
NACHWEIS
DER
P6-MRNA
IN
BOVINEN
LEUKOZYTEN
.
71
3.2.13
NACHWEIS
DER
BOVINEN
MCP-L-MRNA
IM
GESCHLECHTSTRAKT
DES
BULLEN
.
72
3.2.14
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
DES
BOVINEN
MCP
1
-GENS
IN
BOVINER
DNA
.
73
3.3
CHARAKTERISIERUNG
EINES
ZUM
BOVINEN
MCP-1
HOMOLOGEN
GENS
.
75
3.3.1
DURCHMUSTERUNG
EINER
COSMID-BIBLIOTHEK
MIT
PH42
ALS
SONDE
.
75
3.3.2
VERGLEICH
DER
ISOLIERTEN
COSMID-KLONE
DURCH
ECORI-RESTRIKTIONS
HYDROLYSE
.
75
3.3.3
RESTRIKTIONSANALYSE
DES
COSMID-KLONS
CL
1/1
.
76
3.3.4
SOUTHERN
MOT-ANALYSE
VON
CL
1/1
.
77
3.3.5
KARTIERUNG
DER
MIT
PH42
HYBRIDISIERENDEN
BEREICHE
VON
CL
1/1
.
78
3.3.6
KLONIERUNG
DER
2
KB
UND
4,4
KB
LANGEN
ECORI-FRAGMENTE
VON
CL
1/1
.
80
3.3.7
SUCHE
NACH
HOMOLOGEN
SEQUENZEN
ZU
PH42
.
80
3.3.8
BESTIMMUNG
DER
ORIENTIERUNG
DER
4,4
KB
UND
2
KB
ECORI-FRAGMENTE
.
81
3.3.9
SEQUENZIERUNG
DER
4,4
KB
UND
2
KB
LANGEN
ECORI-FRAGMENTE
.
82
3.3.10
AMPLIFIKATION
EINER
CDNA
SPEZIFISCH
FUER
DAS
ZU
PH42
HOMOLOGE
GEN
.
83
3.3.11
KLONIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
.
85
3.3.12
SEQUENZIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
.
85
3.3.13
ANALYSE
DER
CDNA-SEQUENZ
VON
PC
11
PCR3/5-1
.
87
3.3.14
SEQUENVERGLEICH
VONPCLLPCR3/5-L
MIT
DER
DATENBANK
GENEMBL
.
87
3.3.15
ANALYSE
DER
VON
PCL
1PCR3/5-1
ABGELEITETEN
PROTEINSEQUENZ
.
88
3.3.16
VERGLEICH
MIT
WEITEREN
BEKANNTEN
MCPS
.
88
3.3.17
DIE
GENEXPRESSION
VON
BOVINEM
MCP-2
.
90
3.3.18
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
.
92
3.3.19
DAS
BOVINE
MCP-2-GEN
.
93
3.3.20
ANALYSE
DER
5'-FLANKIERENDEN
REGION
DES
BOVINEN
MCP-2-GENS
.
95
3.4
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
SAUREN
PROTEINS
AUS
DEM
SEKRET
DER
BOVINEN
BLAESCHENDRUESE
.
97
3.4.1
NACHWEIS
DES
ANTI-TGFB3-IGG-REAKTIVEN
PROTEINS
IM
SEKRET
DER
BOVINEN
BLAESCHENDRUESE
.
97
3.4.2
TRENNUNG
DES
CM-DURCHLAUFS
DURCH
DEAE-SEPHADEX
A25
CHROMATOGRAPHIE
.
97
3.4.3
FAST
PROTEIN
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(FPLC)
DER
DEAE
ELUATFRAKTION
MIT
0,1
M
NACL
.
98
3.4.4
GEWINNUNG
SPEZIFISCHER
IGGS
GEGEN
DAS
14
KDA-PROTEIN
.
100
3.4.5
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
14
KDA-PROTEINS
.
102
3.5
CHARAKTERISIERUNG
EINER
CDNA
SPEZIFISCH
FUER
ASFP
.104
3.5.1
DURCHMUSTERUNG
DER
CDNA-BIBLIOTHEK
SVS2B
MIT
ANTI-ASFP-IGGS
.104
3.5.2
ANALYSE
DER
ISOLIERTEN
ANTI-ASFP-IGG-SPEZIFISCHEN
CDNA-KLONE
.
104
3.5.3
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
EINES
KLONES
AUS
GRUPPE
A
.
105
3.5.4
VERGLEICH
DER
KLONE
AUS
GRUPPE
B
.
106
3.5.5
ANALYSE
DES
CDNA-KLONSPTF21
.
106
3.5.6
ANALYSE
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
ASFP
.
108
3.5.7
SEQUENZVERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
ASFP
MIT
DER
DATENBANK
SWISSPROT
.
109
3.5.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
IMMUNOLOGISCHEN
HOMOLOGIE
ZWISCHEN
HUMANEM
TGFB3
UND
ASFP
.
111
3.5.9
DIE
GENEXPRESSION
VON
ASFP
.
112
3.5.10
SOUTHERN
MOT-ANALYSE
.
113
3.5.11
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
MIT
PTF21
IN
UNTERSCHIEDLICHEN
SAEUGETIEREN
.
114
4.
DISKUSSION
.
116
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
136
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
137
7.
ABKUERZUNGEN
.
151
7.1
ALLGEMEINE
ABKUERZUNGEN
.
151
7.2
AMINOSAEUREN
.
153
LEBENSLAUF
.
154 |
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