Nachweis von Hepatitis-C-Virus-RNA in humanen peripheren mononukleären Leukozyten mit einer nicht radioaktiven In-situ-Hybridisierung:
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Veröffentlicht: |
1994
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Beschreibung: | Heidelberg, Univ., Diss., 1994 |
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3
INHALTSVERZEICHNIS
1. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 6
2. EINLEITUNG G
2.1 HISTORISCHER HINTERGRUND 8
2.2 CHARAKTERISIERUNG DES HNANB ERREGERS 10
2.2.1 ISOLIERUNG DER HCV RNA 10
2.2.2 STRUKTUR UND FUNKTION DES HCV GENOMS
11
2.2.3 GENOMISCHE ORGANISATION DES HCV 12
2.2.4 HETEROGENITAET DES HCV
15
2.3 DIAGNOSTIK DER HCV INFEKTION
15
2.3.1 ANTIKOERPEMACHWEIS
15
2.3.1.1 ENZYME IINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 15
2.3.1.2 REKOMBINANTER IMMUNOBLOT ASSAY (RIBA) 16
2.3.2 HCV RNA NACHWEIS 16
2.3.2.1 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 16
2.3.2.2 2H SITU-HYBRIDISIERUNG (ISH) 17
3. ZIEL DER ARBEIT
19
4. MATERIAL UND METHODEN 20
4.1 MATERIAL 20
4.1.1 CHEMIKALIEN 20
4.1.2 RESTRIKTIONSENZYME UND SUBSTANZEN FUER MOLEKULAR- 21
BIOLOGISCHE ANSAETZE
4.1.3 VEKTOREN 22
4.1.3.1 PLASMID ZUR HERSTELLUNG DER SENSE- UND ANTI-SENSE 22
RNA-SONDE ZUR DETEKTION VON PLUS- UND MINUS STRANG
HCV RNA
4.1.3.2 VEKTOR ZUR TRANSFEKTION VON COS-ZELLEN MIT HCV CDNA 23
4.1.4 ZUSAMMENSETZUNG UND ANSAETZE WICHTIGER LOESUNGEN 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4
4.1.5 PATIENTEN
L*
4.2 METHODEN 26
4.2.1. ISOLIERUNG VON PERIPHEREN MONONUKLEAEREN LEUKOZYTEN 26
(PBML)
4.2.2 FIXATION VON PBML AUF GLASOBJEKTTRAEGEM 27
4.2.3 HERSTELLUNG DER RNA-SONDEN FUER DIE IN SITU- 27
HYBRIDISIERUNG
4.2.3.4 HERSTELLUNG DER ANTI-SENSE UND DER SENSE-RNA-SONDE 28
FUER DIE DETEKTION VON PLUS- UND MINUS-STRANG HCV RNA
4.2.4
IN SITU-HYBRIDISIERUNG ZUR DETEKTION VON PLUS-STRANG 31
HCV RNA IN PBML UND IN COS-ZELLEN
4.2.5
HI SITU-HYBRIDISIERUNG ZUR DETEKTION VON MINUS-STRANG 34
HCV RNA UND VON SS-ACTIN-MRNA
4.2.6 TRANSFEKTION VON COS-ZELLEN MIT HCV CDNA 34
5. ERGEBNISSE
36
5.1 OPTIMIERUNG DER
IN SITU-HYBRIDISIERUNG 36
5.1.1 EINFLUSS DER PBML-KONZENTRATION 36
5.1.2 EINFLUSS DER HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUR 36
5.1.3 EINFLUSS DER INKUBIERUNG MIT 0,2N HCL 36
5.1.4 EINFLUSS DER DAUER DER TROCKNUNG DER PRAEPARATE VOR DER 37
HYBRIDISIERUNG
5.1.5 EINFLUSS DES VERDAUS MIT PROTEINASE K 37
5.1.6 EINFLUSS DER KONZENTRATION DER RNA-SONDE IN DER 41
HYBRIDISIERUNGSLOESUNG
5.2
IN SITU-HYBRIDISIERUNG ZUM NACHWEIS VON PLUS- UND 42
MINUS-STRANG HCV RNA IN PBML
5.3
IN SI TU-HYBRIDISIERUNG FUER HCV RNA IN 45
LEBERPARAFFINSCHNITTEN
5
5.4
6
.
7.
8
.
9.
10
.
IN SITU
-HYBRIDISIERUNG FUER HCV RNA IN TRANSFIZIERTEN
COS-ZELLEN
DISKUSSION
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATURVERZEICHNIS
LEBENSLAUF
DANKSAGUNG
48
50
54
56
70
71 |
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