Untersuchungen zur Veränderung der Genexpression bei der Bildung somatischer Embryonen von Digitalis lanata (Erhr.):
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1994
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3
UNTERSUCHUNGEN ZUR VERAENDERUNG DER GENEXPRESSION
BEI DER BILDUNG SOMATISCHER EMBRYONEN VON DIGITALISLANATA (ERHR.)
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
DOCTOR RERUM NATURALIUM (DR. RER. NAT.)
VORGELEGT DER
MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER
MARTIN-LUTHER-UNIVERSITAET HALLE-WITTENBERG
VON DIPL. BIOL. ANGELA PETERSON GEB. AM 9. OKTOBER 1964 IN: COTTBUS
GUTACHTER:
2. ^
3. *O
HALLE (SAALE), JANUAR 1994
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. GENEXPRESSIONSVERAENDERUNGEN WAEHREND DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE 1
1.2. DIGITALIS LANATA- MODELL ZUR UNTERSUCHUNG DER SOMATISCHEN
EMBRYOGENESE 2
2. MATERIAL UND METHODEN 5
2.1. VERWENDETES PFLANZENMATERIAL UND KULTIVIERUNGSSCHEMA 5
2.2. CHLOROPHYLLBESTIMMUNG 6
2.3. MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 6
2.3.1. PROTEINBIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 6
2.3.1.1. PROTEINISOLATION 6
2.3.1.1.1. ISOLATION INTRAZELLULAERER PROTEINE 6
2.3.1.1.2. ISOLATION EXTRAZELIULAERER PROTEINE 6
2.3.1.2. PROTEINAUFTRENNUNG IN POLYACRYLAMIDGELEN 7
2.3.1.3. WESTERN-BLOT-HYBRIDISIERUNG 7
2.3.2. UNTERSUCHUNGEN AUF RNA-EBENE 7
2.3.2.1. BESTIMMUNG DER ENDOGENEN RNASE-AKTIVITAET 7
2.3.2.2. ISOLATION VON RNA 8
2.3.2.2.1. ISOLATION VON GESAMT-RNA 8
2.3.2.2.2. ISOLATION VON ANGEREICHERTER MRNA 8
2.3.2.3. EINSCHAETZUNG DER RNA-PRAEPERATIONEN NACH QUANTITAET
UND REINHEIT 8
2.3.2.4. RNA-AUFTRENNUNG IN DENATURIERENDEN FORMALDEHYDGELEN 8 2.3.2.5.
NORTHERN-TRANSFER 9
2.3.2.6. NORTHERN-BLOT-HYBRIDISIERUNG 9
2.3.2.7. IN VITRO TRANSLATION VON RNA-PROBEN 9
2.3.3. HERSTELLUNG VON HYBRIDISIERUNGSSONDEN 10
2.3.3.1. VERWENDETE PLASMIDE 10
2.3.3.2. BAKTERIENTRANSFORMATION UND-KULTIVIERUNG 10
2.3.3.3. ISOLATION UND AUFTRENNUNG VON PLASMID-DNA 11
2.3.3.4. RESTRIKTION VON PLASMID-DNA UND ISOLATION VON DNA- INSERTS 11
2.3.3.5. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 11
IMAGE 3
3. ERGEBNISSE 12
3.1. BILDUNG SOMATISCHER DIGITALIS-EMBRYONEN AUS PROEMBRYO- GENEN MASSEN
UND SYNCHRONISATION WICHTIGER STADIEN
DER EMBRYOENTWICKLUNG 12
3.2. UNTERSUCHUNGEN VON VERAENDERUNGEN DER GENEXPRESSION WAEH- REND DER
SOMATISCHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 17 3.2.1. PROTEINSPEKTREN
DER EINZELNEN EMBRYOGENESESTADIEN VON DIGITALIS LANATA 17
3.2.1.1. VERGLEICH DER INTRAZELLULAEREN PROTEINE 17
3.2.1.2. VERGLEICH DER EXTRAZELLULAEREN PROTEINE 21
3.2.1.3. VERGLEICH DER IN VIVO UND IN VITRO SYNTHETISIERTEN PROTEINE IN
DER FRUEHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 24
3.2.2. UNTERSUCHUNG DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA
AUF RNA-EBENE 28
3.2.2.1. BESTIMMUNG DER ENDOGENEN RNASE-AKTIVITAET EINZELNER STADIEN DER
EMBRYOENTWICKLUNG 28
3.2.2.2. METHODENOPTIMIERUNG ZUR ISOLATION VON GESAMT- UND MRNA 29
3.2.2.3. SUCHE NACH EMBRYOGENESESPEZIFISCH EXPRIMIERTEN GENEN-
EXPRESSION HOMOLOGER GENE AUS DAUCUS CAROTA IM VERLAUF DER SOMATISCHEN
EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 33
3.2.2.3.1. NORTHERNHYBRIDISIERUNG MIT DEM CDNA-KLON DE 2.15 33
3.2.2.3.2. NORTHERNHYBRIDISIERUNG MIT DEM CDNA-KLON DE 9.1 36 3.2.2.3.3.
NORTHERNHYBRIDISIERUNG MIT DEM CDNA-KLON DE 3 39
3.2.3. EXPRESSION KLEINER HITZESCHOCKGENE IM VERLAUF DER SOMATISCHEN
EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 42
3.2.3.1. UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION EINES DEM HSP 17 HOMOLOGEN
GENS AUF RNA- UND PROTEINEBENE 42
3.2.3.2. EXPRESSION EINES DEM MSHSP 18.2 GEN AUS MEDICAGO SATIVA
HOMOLOGEN GENS IN EMBRYONEN VON DIGITALIS LANATA 46 3.2.4 HORMONE UND
EMBRYOGENESE 48
3.2.4.1. INDUKTION EINES 62 KD PROTEINS IM VERLAUF DER SOMATISCHEN
EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA BZW. NACH OSMOTISCHEM STRESS UND
ABA-BEHANDLUNG 48
3.2.4.2. DIE EXPRESSION EINES HOMOLOGEN LEA-GENS (B 19.1) AUS HORDEUM
VULGAERE IN SOMATISCHEN EMBRYONEN VON DIGITALIS LANATA 50
3.2.4.3. SUCHE NACH HOMOLOGEN TRANSKRIPTEN FUER JIP S AUS HORDEUM VULGAERE
IN SOMATISCHEN Z)/G77A//S-EMBRYONEN 52
IMAGE 4
4. DISKUSSION 53
4.1. CHARAKTERISIERUNG DER EMBRYOGENESESTADIEN VON DIGITALIS LANATA 53
4.2. VERAENDERUNG DER GENEXPRESSION WAEHREND DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE
VON DIGITALIS LANATA 55
4.2.1. EXPRESSION KONSERVIERTER EMBRYOGENESESPEZIFISCHER GENE IM VERLAUF
DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 5 5 4.2.1.1.
EXPRESSION HOMOLOGER TRANSKRIPTE FUER DIE GENE DE 2.15, DE 9.1 UND DE 3
AUS DAUCUS CAROTA 55
4.2.1.2. EXPRESSION VON RNA-TRANSKRIPTEN IN SOMATISCHEN DIGITALIS-
EMBRYONEN, DIE LEA-GENEN AUS DAUCUS CAROTA {DE 3) UND HORDEUM VULGAERE (B
19.1) HOMOLOG SIND 58
4.2.2. VERAENDERUNG DER GENEXPRESSION AUF PROTEINEBENE IM VERLAUF DER
SOMATISCHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 60 4.2.2.1. VERAENDERUNG
DER SPEKTREN IN VIVO SYNTHETISIERTER INTRAZELLULAERER PROTEINE 60
4.2.2.2. STADIENSPEZIFISCHE SEKRETION UND MOEGLICHE FUNKTION VON
EXTRAZELLULAEREN PROTEINEN 61
4.2.3. EINFLUSS VON PHYTOHORMONEN AUF DEN VERLAUF DER EMBRYOGENESE BEI
DIGITALIS LANATA 64
4.2.3.1. DER EINFLUSS VON AUXIN AUF DIE BILDUNG SOMATISCHER EMBRYONEN 64
4.2.3.2. ABSCISINSAEURE 65
4.2.3.3. (-)-JASMONSAEUREMETHYLESTER 68
4.2.4. EMBRYOGENESE UND STRESS- EXPRESSION KLEINER HITZESCHOCK-
PROTEINE IM VERLAUF DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA 70
4.2.5. POSTTRANSKRIPTIONELLE UND TRANSLATIONELLE GENEXPRESSIONS-
VERAENDERUNGEN BEI DER BILDUNG SOMATISCHER DIGITALIS- 75 EMBRYONEN 4.3.
AUFSTELLUNG EINER SUBTRAKTIVEN CDNA-BANK FUER DIE FRUEHE
EMBRYOGENESE VON DIGITALIS LANATA SOWIE WEITERFUEHRENDE ARBEITEN 76
5. ZUSAMMENFASSUNG 77
6. LITERATURVERZEICHNIS 81
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