Screening nach Mikroorganismen mit zellwandlytischer Aktivität gegen verschiedene basidiomycetale Hefen und Untersuchung sowie Anwendung der zellwandlytischen Enzyme von Acremonium spec.:
Gespeichert in:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
A.
EINLEITUNG
1
1.
AUFBAU
VON
PILZZELLWAENDEN
1
2.
ZELLWANDLYTISCHE
ENZYME
8
3.
ANWENDUNG
VON
ZELLWANDLYTISCHEN
ENZYMEN
11
B.
PROBLEMSTELLUNG
U
C.
MATERIAL
UND
METHODEN
15
1,
CHEMIKALIEN
15
2,
VE
RWENDETE
MIKROORGANISMEN
15
3.
NAEHRMEDIEN
UND
KULTURBEDING
UN
G
EN
16
3.1.
KULTIVIERUNG
DER
TESTHEFEN
16
3.1.1.
STAMMHALTUNG
16
3.1.2.
ANZUCHT
IN
SCHUETTELKULTUR
ZUR
PRODUKTION
VON
ZELL
BZW.
16
ZELLWANDMATERIAL
3.1.3.
ANZUCHT
IM
3
5
1-RUEHRFERMENTER
ZUR
PRODUKTION
VON
ZELL
17
WANDMATERIAL
3.1.4.
ANZUCHT
IN
SCHUETTELKULTUR
FUER
PROTOPLASTIERUNGSVERSUCHE
17
3.1.5.
MEDIEN
ZUR
REGENERATION
VON
PROTOPLASTEN
18
3.1.6.
SELEKTIONSAGAR
ZUR
ANZUCHT
TRANSFORMIERTER
HEFEZELLEN
18
3.2.
KULTIVIERUNG
DES
PRODUZENTEN
19
3.2.1.
MEDIEN
ZUM
SCREENING
AUF
ORGANISMEN
MIT
ZELLWAND
19
LYTISCHER
AKTIVITAET
3.2.2.
MEDIEN
ZUR
REINZUCHT
ZELLWANDLYTISCHER
MIKROORGANIS
19
MEN
UND
ZUR
UEBERPRUEFUNG
IHRER
LYTISCHEN
AKTIVITAET
3.2.3.
MEDIEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
MIKROORGANISMEN
19
3.2.4.
STAMMHALTUNG
20
3.2.5.
MEDIUM
ZUR
PRODUKTION
LYTISCHER
ENZYME
20
3.2.6.
MEDIENOPTIMIERUNG
21
4.
GEWINNUNG
VON
ZELLWANDMATERIAL
22
INHALTSVERZEICHNIS
5.
DURCHFUEHRUNG
DES
SCREENING
S
23
5.1.
PROBENENTNAHME
UND
-AUFBEWAHRUNG
23
5.2.
PROBENVORBEREITUNG
23
5.3.
DURCHFUEHRUNG
23
6.
MORPHOLOGISCHE
BESTIMMUNG
DER
ISOLIERTEN
MIKROORGANISMEN
24
7.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
KOHLENHYDRAT
24
ANTEILS
DER
ZELLWAENDE
VON
TESTHEFEN
UND
PRODUZENT
7.1.
PROBENVORBEREITUNG
24
7.2.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
DER
PROBE
25
7.2.1.
TFA-HYDROLYSE
DER
ZELLWAENDE
25
7.2.2.
DERIVATISIERUNG
DER
MONOMERE
26
7.2.3.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
DER
ZUCKERDERIVATE
26
8,
NACHWEISMETHODEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
LYTISCHER
ENZYME
27
8.1,
NACHWEIS
DER
ZELLWANDLYTISCHEN
GESAMTAKTIVITAET
27
8.1.1.
LOCHPLATTENTEST
27
8.2.1.
OPTISCHER
LYSETEST
28
8.2,
NACHWEIS
KOHLENHYDRATSPALTENDER
ENZY
ME
28
8.3,
NACHWEIS
VON
CHITINASEN
30
8.3.1.
HERSTELLUNG
VON
GEREINIGTEM
CHITIN
31
8.3.2.
HERSTELLUNG
VON
CHITINPULVER
31
8.3.3.
HERSTELLUNG
VON
WASSERLOESLICHEM
CARBOXYMETHYLCHITIN
31
(CM-CHITIN)
8.3.4.
HERSTELLUNG
VON
REMAZOL
BRILIANT
VIOLET
5R
GEFAERBTEM
32
CM-CHITIN
(RBV-CM-CHITIN)
8.3.5.
NACHWEIS
VON
CHITINASEAKTIVITAET
MIT
RBV-CM-CHITIN
33
8.4.
NACHWEIS
VON
PROTEASEN
33
8.5,
NACHWEIS
KOHLENHY
DRATSPALTENDER
ENZYME
IN
SPS
BZW.
34
NATIVEN
POLYACRYLAMIDGELEN
NACH
ELEKTROPHORETISCHER
TRENNUNG
8.5.1.
NACHWEIS
DER
CHITINASE
34
8.5.2.
NACHWEIS
DER
SS-L,4-MANNANASE
35
8.5.3.
NACHWEIS
DER
A-L,4-GLUCANASE
36
8.6.
PROTEINGEHALTBESTIMMUNG
36
INHALTSVERZEICHNIS
9,
REINIG
UN
G
DER
LYTISCHEN
ENZYME
36
9.1.
REINIGUNG
DER
KULTURBRUEHE
36
9.1.1.
ABTRENNUNG
VON
FESTEN
BESTANDTEILEN
36
9.1.2.
EINENGUNG
DER
KULTURBRUEHE
UND
ABTRENNUNG
NIEDER
37
MOLEKULARER
VERUNREINIGUNGEN
9.2.
REINIGUNG
VON
EINZELENZYMEN
37
9.2.1.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
38
9.2.1.1.
GELFILTRATION
38
9.2.1.2.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
40
9.2.1.3.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
40
9.2.2.
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
41
9.2.2.1.
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNUNG
IM
POLYACRYLAMIDGEL
41
(PAA-GEL)
9.2.2.2.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
42
9.2.2.3.
ELEKTROELUTION
VON
EINZELENZYMEN
AUS
PAA-GELEN
43
10.
CHARAKTERISIERUNG
DER
LYTISCHEN
ENZYME
43
10.1,
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
43
10.2,
ISOELEKTRISCHER
PUNKT
(IEP)
43
10.3,
SUBSTRATSAETTIGUNGSKURVE
43
10.4.
PH-OPTIMUM
44
10.5,
TEMPERATUROPTIMUM
UND
AKTIVIERUNGSENERGIE
44
10.6.
TEMPERATURSTABILITAET
UND
INAKTIVIERUNGSENERGIE
44
10.7.
SPALTUNGSMECHANISMUS
44
10.7.1.
FREISETZUNG
VON
ZUCKERMONOMEREN
UND
-OLIGOMEREN
AUS
45
ZELLWAENDEN
10.7.2.
FREISETZUNG
VON
ZUCKERMONOMEREN
UND
-OLIGOMEREN
AUS
45
DEFINIERTEM
SUBSTRAT
11,
ANWENDUNG
DER
ZEL
LWANDLYTISCHEN
ENZYME
45
LL.L.PROTOPLASTIERUNG
45
11.2.
ORTHOGONAL
FIELD
ALTEMATION
GELELECTROPHORESIS
(OFAGE)
ZUR
47
TRENNUNG
DER
CHROMOSOMEN
VON
SPOROHOLOMYCES
SALMONICOLOR
DSM
70851
11.3.
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
YNN
281A
50
11.4.
NAEHRBODENZUSATZ
ZUR
UNTERDRUECKUNG
VON
HEFEWACHSTUM
51
INHALTSVERZEICHNIS
D.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
52
1.
ISOLATION
UND
BESTIMMUNG
VON
MIKROORGANISMEN
MIT
52
ZELLWANDLYTISCHER
AKTIVITAET
2.
BESCHREIBUNG
DES
ISOLIERTEN
ENZYMPRODUZENTEN
57
ACREMONIUM
SPEC.
3.
STAMMHALTUNG
DES
PRODUZENTEN-STAMMES
61
4.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
_
ANALYSE
_DER_
ZELLWANDZUSAMMEN
62
SETZUNG
DER
VERWENDETEN
TESTHEFEN
SOWIE
DES
ISOLIERTEN
ENZYM
PRODUZENTEN
5,
TESTMETHODEN
ZUM
NACHWEIS
ZE
LLWANDLYTI
SCHER
ENZYME
68
5.1.
LOCHPLATTENTEST
68
5.2,
OPTISCHER
LYSETEST
68
6.
MEDIENOPTIMIERUNG
75
6.1.
EINFLUSS
DER
EINGESETZTEN
MENGE
ZELLWANDMATERIAL
76
6.2.
EINFLUSS
DER
ANIMPFMENGE
DES
PRODUZENTEN
77
6.3.
EINFLUSS
DES
ANFANGS
PH-WERTES
AUF
DIE
LYTISCHE
AKTIVITAET
79
6.4.
EINFLUSS
DER
C-OUELLE
AUF
DIE
PRODUKTION
ZELLWANDLYTISCHER
80
ENZYME
7.
REINIG
UN
G
DER
KULTURBRFLHE
85
8,
NACHWEIS
VON
CHITINASE
88
9.
CHARAKTERISIERUNG
DES
ZELLWANDLYTISCHEN
ENZYMGEMISCHES
91
9.1.
FREISETZUNG
VON
ZUCKERMONOM
EREN
UND
-
OLIGOMEREN
AUS
92
GEREINIGTEN
ZELLWAENDEN
DURCH
DAS
ENZYMGEMISCH
9.2.
AUSWAHL
GEEIGNETER
SUBSTRATE
ZUR
NAEHEREN
UNTERSUCHUNG
DER
93
EINZELAKTIVITAETEN
9.3,
CHARAKTERISIERUNG
DER
CI-L
F
4-GLUCANASEAKTIVITAET
IM
97
ENZYMGEMISCH
9.
4
.
CHARAKTERISIERUNG
DER.
SS-U
-
GLUEANASEAKTIVITAET
IM
99
ENZYMGEMISCH
9.5.
CHARAKTERISIERUNG
D
ER
SS-1.6-GLUCANASEAKTIVITAET
IM
101
ENZYMGEMISCH
9.6.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SS
1
.4-MANNANASEAKTIVITAET
IM
103
ENZYM
GEMISCH
9.7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEASE
AKTIVITAET
I
M
ENZYMGEMISCH
105
9.8.
CHARAKTERISIERUNG
D
ER
CHITINASEAKTIVITAET
IM
ENZYMGEMISCH
106
10.
PRODUKTION
ZELLWANDLYTISCHER
ENZYME
108
10.1,
PRODUKTION
IM
5
1-RUEHRFERMENTER
108
10.2,
PRODUKTION
VON
CHITINASE
110
10.3.
VERGLEICH
DER
AUF
ZELLWAENDEN
UND
CHITIN
GEBILDETEN
115
ENZYMGEMISCHE
BEZUEGLICH
IHRER
WIRKUNG
IM
OLT
11,
REINIG
UN
G
DER
ENZYME
116
11.1,
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNGSVERFAHREN
117
11.1.1.
VERSUCHE
ZUR
AUFREINIGUNG
VON
EINZELAKTIVITAETEN
AUS
DEM
117
ENZYMGEMISCH
SPO-LY
MITTELS
GELCHROMATOGRAPHIE
11.1.2.
VERSUCHE
ZUR
AUFREINIGUNG
VON
EINZELAKTIVITAETEN
AUS
DEM
120
ENZYMGEMISCH
SPO-LY
MITTELS
LONENAUSTAUSCH
CHROMATOGRAPHIE
11.1.3.
AUFREINIGUNG
DER
CHITINASE
AUS
DEM
ENZYMGEMISCH
CHI
122
LY
MITTELS
AFFMITAETSCHROMATOGRAPHIE
11.2.
REINIGUNGSVERFAHREN
MITTELS
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
125
11.2.1.
ELEKTROPHORETISCHE
REINIGUNG
DER
CHITINASE
125
11.2.2.
ELEKTROPHORETISCHE
REINIGUNG
WEITERER
ENZYME
128
11.2.2.1.
ISOLATION
EINER
A
1
,4-GLUCANASE
128
11.2.2.2.
ISOLATION
EINER
SS-L,4-MANNANASE
129
12,
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
CHITINASE
132
12.1,
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
MITTELS
SPS
132
GELELEKTROPHORESE
12,2.
BESTIMMUNG
DES
LEP'S
MITTELS
ISOELEKTRISCHER
FO
KUSSIERUNG
133
12.3,
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
134
12.4.
BESTIMMUNG
DES
T
EMPERATUROPTIMUMS
UND
DER
135
AKTIVIERUNGSENERGIE
12.5,
BESTIMMUNG
DER
TEMPERATURSTABILITAET
UND
DER
137
INAKTIVIERUNGSENERGIE
INHALTSVERZEICHNIS
12.6.
AUFNAHME
VON
ZEITVERLAUFSKURVEN
139
12.9.
ZUSAMMENFASSUNG
D
ER
PROTEINCHEMISCHEN
D
ATEN
DER
CHITINASE
141
13.
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
SS-L,4-MANNANASE
142
13.1.
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
MITTELS
SPS
142
GELELEKTROPHORESE
13.2.
BESTIMMUNG
DES
ISOELEKTRISCHEN
PUNKTES
MITTELS
IEF
142
13.3,
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
144
13.4,
BESTIMMUNG
DES
TEMPERATUROPTIMUMS
UND
DER
144
AKTIVIERUNGSENERGIE
115.
BESTIMMUNG
DER
TEMPERATURSTABILITAET
UND
DER
146
INAKTIVIERUNGSENERGIE
13.6,
AUFNAHME
VON
ZEITVERLAUFSKURVEN
UND
BESTIMMUNG
VON
K
M
147
SOW
I
E
V
MAX
13.7.
ERMITTLUNG
DES
SPALTUNGSMODUS
DER
GEREINIGTEN
SS-1.4
149
MANNANASE
13.8,
WIRKUNG
DER
SS-1.4-MANNANASE
AUF
GEREINIGTE
ZELLWAENDE
VON
150
SPOROBOLOMYCES
SALMONICOLOR
13.9,
ZUSAMMENFASSUNG
DER
PROTEINCHEMISCHEN
DATEN
DER
SS-1.4
151
MANNANASE
14.
VERSUCHE
ZUR
ANW
ENDUNG
DES
ZELLWANDLYTISCHEN
ENZYM
152
GEMISCHES
VON
ACREMONIUM
SPEC,
14.1,
PROTOPLASTIERUNGSVERSUCHE
MIT
VERSCHIEDENEN
HEFEN
152
14.2,
EINSATZ
DES
ZELLWANDLYTISCHEN
E
NZYMGEMIS
CHES
BEI
DER
KARYO
159
TYPISIERUNG
VON
SPOROBOLOMYCES
SALMONICOLOR
DSM
70851
MITTELS
OFAGE
14.3,
EINSATZ
DES
ZELLWANDLYTISCHEN
ENZYMGEMISCHES
ZUR
161
TRANSFORMATION
VON
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
14.4.
EINSATZ
DES
ZELLWANDLYTISCHEN
ENZYMGEMISCHES
ALS
NAEHRBODEN
162
ZUSATZ
ZUR
UNTERDRUECKUNG
VON
HEFEWACHSTUM
E,
ABSCHLUSSDISKUSSION
UND
AUSBLICKE
164
F,
ZUSAMMENFASSUNG
179
G.
LITERATURVERZEICHNIS
180 |
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