Immuncytochemische Visualisierung von Oberflächenrezeptoren in Pflanzenzellen unter besonderer Berücksichtigung ihrer Internalisierung durch rezeptorvermittelte Endocytose:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Göttingen
Cuvillier
1994
|
| Ausgabe: | 1. Aufl. |
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Göttingen, Univ., Diss., 1994 |
| Beschreibung: | VII, 187 S. Ill., graph. Darst. |
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T
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
.
1
1
EINLEITUNG
.
4
1.1
KONZEPTIONEN
ZUR
ERKENNUNG
EXTRAZELLULAERER
SIGNALE
UND
DEREN
UEBERTRAGUNG
INS
ZELLINNERE
.
4
1.1.1
REZEPTORDOGMA
.
4
1.1.2
"SECOND
MESSENGER
"
KONZEPT
.
5
1.1.3
ADAPTATION
UND
"DOWN
REGULATION"
.
6
1.2
REZEPTORVERMITTELTE
ENDOCYTOSE
(RME)
IN
TIERISCHEN
ZELLEN
.
7
1.2.1
ABGRENZUNG
VON
ANDEREN
FORMEN
CYTOTISCHER
PROZESSE
.
7
1.2.2
BEDEUTUNG
DER
RME
IN
TIERISCHEN
ZELLEN
.
8
1.2.3
"CLUSTERING
UND
"TRAPPING"
VON
MEMBRANPROTEINEN
ALS
OBERFLAECHENPHAENOMENE
BEI
DER
RME
.
8
1.2.4
INTERNALISIERUNG
DER
REZEPTOR-LIGAND-KOMPLEXE
UND
INTRAZELLULAERE
ROUTEN
DER
RME
.
10
1.2.5
ULTRASTRUKTUR
VON
ENDOSOMEN
UND
LYSOSOMEN
.
11
1.2.6
CLATHRINUNABHAENGIGE
AUFNAHME
SPEZIFISCHER
MEMBRANABSCHNITTE
.
12
1.3
REZEPTORPROTEINE
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
PFLANZENZELLEN
.
13
1.3.1
AUXIN-REZEPTOREN
.
13
1.3.2
REZEPTOREN
FUER
ELICITOREN
.
15
1.4
ENDOCYTOSE
IN
PFLANZENZELLEN
.
17
1.4.1
ENDOCYTOSE
IM
ALLGEMEINEN
.
17
1.4.1.1
ERSTE
STUDIEN
IN
DEN
60ER
UND
70ER
JAHREN
.
17
1.4.1.2
THEORETISCHE
BETRACHTUNGEN
ZUM
TURGORPROBLEM
UND
ZUR
MEMBRANFLUSSTHEORIE
.
19
1.4.1.3
HINWEISE
AUF
"COATED"
VESIKEL
VERMITTELTE
ENDOCYTOSEWEGE
IN
PFLANZEN
.
21
1.4.1.4
VERSUCHE
ZUR
ENDOCYTOSE
MIT
HILFE
VON
FLUORESZENZFALBSTOFFEN
.
22
1.4.2
REZEPTORGEKOPPELTE
ENDOCYTOSE
IN
PFLANZEN
.
24
1.5
ZIELSETZUNG
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
.
25
II
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
27
2.1
VERSUCHSSYSTEME
.
27
2.1.1
SUSPENSIONSKULTUREN
VON
PETERSILIE,
ELICITOREN
UND
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
27
2.1.2
MAISKOLEOPTILEN,
AUXINBINDUNGSPROTEIN
UND
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
28
2.2
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
29
2.2.1
NAEHRMEDIUM
FUER
SUSPENSIONSKULTIVIERTE
PETERSILIENZELLEN
.
29
2.2.2
ANZUCHT
UND
UBERIMPFUNG
DER
SUSPENSIONSKULTUR
.
30
2.2.3
ANZUCHT
VON
MAISKEIMLINGEN
.
31
2.3
ISOLIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
.
31
2.3.1
MESSUNG
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
IN
ENZYMGEMISCHEN
MITTELS
AZOCASEINASETEST
.
31
2.3.2
PROTOPLASTIERUNG
BEI
GERINGSTER
PROTEOLYTISCHER
BELASTUNG
.
33
2.3.2.1
ISOLIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
SUSPENSIONS
KULTIVIERTER
PETERSILIENZELLEN
.
33
2.3.2.2
ISOLIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
AUS
MAISKOLEOPTILEN
.
34
2.4
BEHANDLUNG
DER
UNTERSUCHTEN
ZELLEN
MIT
IHREN
LIGANDEN
.
35
2.4.1
INKUBATION
DER
PETERSILIENZELLEN
IN
SITU
UND
IHRER
PROTOPLASTEN
MIT
ELICITOREN
.
35
2.4.1.1
MESSUNG
DER
FURANOCUMARINPRODUKTION
NACH
ROHELICITORZUGABE
.
35
2.4.1.2
INKUBATION
MIT
HOCHREINEM
ELICITOR
FUER
MIKROSKOPISCHE
ZWECKE
.
36
2.4.1.3
BESONDERE
INKUBATIONSTECHNIKEN
FUER
SPEZIELLE
FRAGESTELLUNGEN
.
36
2.4.2
INKUBATION
DER
MAISKOLEOPTIL-PROTOPLASTEN
MIT
AUXIN
BZW.
ANTIKOERPERN
.
37
2.5
KONVENTIONELLE
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
38
2.5.1
FIXIERUNG
VON
SUSPENSIONSKULTIVIERTEN
PETERSILIENZELLEN
.
38
2.5.2
FIXIERUNG
VON
PROTOPLASTEN
DER
SUSPENSIONSKULTUR
.
39
2.5.3
KONTRASTIERUNG,
ENTWAESSERUNG
UND
EINBETTUNG
.
40
2.5.4
FORMVAIBESCHICHTUNG
DER
EM-TRAEGEMETZCHEN
UND
ULTRAMIKROTOMIE
.
41
2.5.5
NACHKONTRASTIERUNG
.
42
2.5.6
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
UND
FOTOGRAFIE
.
42
IN
2.6
IMMUN-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
(IEM)
.
43
2.6.1
"PREEMBEDDING
"
METHODEN
.
43
2.6.1.1
MARKIERUNG
VON
ELICITOR
AN
DER
OBERFLAECHE
VON
PROTOPLASTEN
AUS
SUSPENSIONSKULTIVIERTEN
PETERSILIENZELLEN
.
43
2.6.1.2
ABSCHAETZUNG
DER
GESAMTZAHL
DER
BINDUNGSSTELLEN
UND
IHRER
DICHTE
AUS
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN
DATEN
.
44
2.6.2
"POSTEMBEDDING"
METHODEN
.
45
2.6.2.1
ERFASSUNG
DER
PRAEPARATIONSBEDINGTEN
ANTIGENIZITAETSVERLUSTE
MITTELS
"DOT
BLOT
SCREENING"
.
45
2.6.2.2
FIXIERUNG
VON
SUSPENSIONSKULTIVIERTEN
PETERSILIENZELLEN
IN
SITU
FUER
DIE
IMMUN-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
46
2.6.2.3
KONTRASTIERUNG,
ENTWAESSERUNG
UND
EINBETTUNG
.
47
2.6.2.4
FORMVARBESCHICHTUNG
DER
EM-TRAEGEMETZCHEN
UND
ULTRAMIKROTOMIE
.
48
2.6.2.5
INKUBATION
DER
SCHNITTE
MIT
ANTIKOERPERN
.
49
2.6.2.6
NACHKONTRASTIERUNG
.
50
2.6.2.7
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
UND
FOTOGRAFIE
.
50
2.7
AUFLICHT-POLARISATIONSMIKROSKOPIE
.
51
2.7.1
PRINZIP
DES
NACHWEISES
KRISTALLINER
SILBERPARTIKEL
DURCH
VERWENDUNG
POLARISIERTEN
LICHTES
.
51
2.7.2
VISUALISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENEN
ELICITORS
AN
DER
OBERFLAECHE
VON
PETERSILIENPROTOPLASTEN
.
53
2.7.3
VISUALISIERUNG
DES
AUXINBINDUNGSPROTEINS
AN
DER
OBERFLAECHE
VON
PROTOPLASTEN
AUS
MAISKOLEOPTILEN
.
55
2.7.4
BESTIMMUNG
DER
DICHTE
VON
PARTIKELN
AN
DER
PROTOPLASTENOBERFLAECHE
.
58
2.7.5
STATISTISCHER
VERGLEICH
DER
ANTIGENDICHTEN
IN
VERSCHIEDENEN
PROBEN
MITTELS
U-TEST
NACH
M
ANN
UND
W
HITNEY
(1947)
.
58
2.7.5.1
BEGRUENDUNG
DER
AUSWAHL
DES
PRUEFVERFAHRENS
.
58
2.7.5.2
PRINZIP
UND
DURCHFUEHRUNG
DES
TESTS
.
59
2.7.6
NACHWEIS
VON
ANTIGENEN
AUF
GEWEBSSCHNITTEN
MITTELS
AUFLICHT-POLARISATIONSMIKROSKOPIE
.
60
2.7.6.1
FIXIERUNG
UND
EINBETTUNG
VON
MAISKOLEOPTILSEGMENTEN
.
61
2.7.6.2
HERSTELLUNG
DER
SCHNITTE
UND
DEREN
BEFESTIGUNG
AUF
DECKGLAESCHEN.
61
2.7.6.3
ANTIKOERPERBEHANDLUNG,
FAERBUNG
UND
EINSCHLUSS
DER
SCHNITTE
.
62
IV
2.8
ISOLIERUNG
VON
"CLATHRIN
COATED"
VESIKELN
(CCV)
AUS
SUSPENSIONSKULTIVIERTEN
PETERSILIENZELLEN
.
64
2.8.1
AUFREINIGUNG
MITTELS
ULTRAZENTRIFIIGATION
VON
ZELLHOMOGENATEN
.
64
2.8.1.1
UEBERPRUEFUNG
DER
REINHEIT
MITTELS
NEGATIVKONTRASTIERUNG
.
67
2.8.2
AUFREINIGUNG
AUS
ZELLHOMOGENATEN
MITTELS
IMMUNOPRAEZIPITATION
.
67
2.8.2.1
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
IMMUNOPRAEZIPITIERTEN
MATERIALS
.
69
2.9
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
69
2.9.1
VORBEHANDLUNG
DER
PROBEN
.
70
2.9.2
HERSTELLUNG
DES
SDS-POLYACRYLAMIDGELS
.
70
2.9.3
FAERBUNG
DES
SDS-POLYACRYLAMIDGELS
.
72
2.10
"WESTERN
BLOTTING"
.
73
2.10.1
UEBERTRAGUNG
DER
PROTEINE
VOM
GEL
AUF
DIE
NITROCELLULOSEFOLIE
.
73
2.10.2
ALKALISCHE
PHOSPHATASEFAERBUNG
.
74
2.11
GEWINNUNG
UND
AUFREINIGUNG
EINES
GEGEN
DIE
SCHWEREN
KETTEN
PFLANZLICHEN
CLATHRINS
GERICHTETEN
ANTIKOERPERS
.
76
2.11.1
ANTIKOERPERAUFTEINIGUNG
UEBER
EINE
PROTEIN
A-SEPHAROSE-SAEULE
.
77
2.12
PROTEINBESTIMMUNGEN
.
78
2.12.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
P
ETERSON
(1977)
.
78
2.12.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
B
RADFORD
(1976)
.
80
2.13
CHEMIKALIENLISTE
.
81
V
3
ERGEBNISSE.
85
3.1
VISUALISIERUNG
VON
BINDUNGSSTELLEN
DES
42
KDA
GLYCOPROTEIN
ELICITORS
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
SUSPENSIONSKULTIVIERTER
PETER
SILIENZELLEN
.
85
3.1.1
ERFUELLUNG
METHODISCHER
VORAUSSETZUNGEN
.
85
3.1.1.1
PROTOPLASTENISOLIERUNG
UNTER
WEITESTGEHENDER
SCHONUNG
DER
PLASMAMEMBRAN
.
85
3.1.1.2
ERHALTUNG
DER
ANTIGENIZITAET
UNTER
FIXIERUNGSBEDINGUNGEN
.
89
3.1.2
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHER
NACHWEIS
DER
BINDUNG
DES
ELICITORS
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
ZELLEN
IN
SITU
UND
VON
PROTOPLASTEN
.
92
3.1.3
POLARISATIONSMIKROSKOPISCHE
ERGEBNISSE
ZUR
BINDUNG
DES
ELICITORS
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
PROTOPLASTEN
.
93
3.1.3.1
ERGEBNISSE
IN
QUALITATIVER
HINSICHT
.
93
3.1.3.2
ERGEBNISSE
IN
QUANTITATIVER
HINSICHT
.
95
3.1.4
UNTERSUCHUNG
MOEGLICHER
INTEMALISIERUNGSPROZESSE
.
99
3.2
VISUALISIERUNG
VON
AUXINBINDUNGSPROTEIN
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
ZELLEN
AUS
MAISKOLEOPTILEN
.
102
3.2.1
ANATOMIE
DER
KOLEOPTILE
.
102
3.2.2
VERTEILUNG
DES
ENDOGENEN
AUXINBINDUNGSPROTEINS
IN
QUERSCHNITTEN
DURCH
KOLEOPTILSEGMENTE
.
102
3.2.3
NACHWEIS
ENDOGENEN
AUXINBINDUNGSPROTEINS
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
PROTOPLASTEN
AUS
MAISKOLEOPTILEN
.
104
3.2.4
AUXININDUZIERTES
"CLUSTERING"
DES
PLASMAMEMBRANGEBUNDENEN
AUXINBINDUNGSPROTEINS
.
106
3.2.5
UNTERSUCHUNGEN
MIT
MONOCLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
SPEZIELLE
EPITOPE
DES
ABP
.
108
3.2.6
VERSUCHE
ZUR
ERHOEHUNG
DER
REZEPTORDICHTE
MITTELS
EXOGEN
APPLIZIERTEN
ABP
.
108
3.2.7
INTERNALISIERUNG
DES
ABP
NACH
LIGANDINDUZIERTEM
"CLUSTERING
"
.
109
3.3
ISOLIERUNG,
AUFREINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
GEGEN
DIE
SCHWEREN
KETTEN
VON
CLATHRIN
AUS
ZUCCHINIHYPOKOTYLEN
.
110
3.3.1
GEWINNUNG
UND
REINIGUNG
DES
ANTISERUMS
.
110
3.3.2
NACHWEIS
DER
EIGNUNG
DES
ANTISERUMS
FUER
IMMUNCYTOCHEMISCHE
ZWECKE
BZW.
FUER
IMMUNOPRAEZIPITATION
.
111
VI
BILDTAFELN
.
114
4
DISKUSSION
.
130
4.1
REZEPTORGEKOPPELTE
ENDOCYTOSE
ALS
PFLANZEN
PHYSIOLOGISCHES
PROBLEM
.
130
4.1.1
METHODISCHE
SCHWIERIGKEITEN
.
130
4.1.2
THEORETISCHE
ASPEKTE
.
131
4.1.3
BETRACHTUNG
BISHERIGER
BERICHTE
UEBER
REZEPTORVERMITTELTE
ENDOCYTOSE
IN
PFLANZEN
.
133
4.2
EXPERIMENTELLE
UND
KONZEPTIONELLE
ERFORDERNISSE
FUER
DEN
NACHWEIS
REZEPTORVERMITTELTER
ENDOCYTOSE
IN
PFLANZENZELLEN
.
135
4.3
IMMUNOGOLD-SILBERVERSTAERKUNGSTECHNIK
ALS
NEUARTIGE
EXPERIMENTELLE
STRATEGIE
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
VON
OBER
FLAECHENREZEPTOREN
AN
PFLANZLICHEN
PROTOPLASTEN
.
138
4.3.1
HISTORISCHE
ASPEKTE
.
138
4.3.2
PRINZIP
DER
SILBERVERSTAERKUNGSREAKTION
.
139
4.3.3
ZUVERLAESSIGKEIT
UND
PRAKTIKABILITAET
VON
SEIG-EPOM
.
140
4.3.4
BISHERIGE
ANWENDUNGEN
VON
SEG-METHODEN
.
142
4.4
NEUE
BEITRAEGE
ZUR
REZEPTORFORSCHUNG
AN
PFLANZEN
.
143
4.4.1
HINWEISE
AUF
SPEZIFISCHE
BINDUNGSPROTEINE
FUER
AUXINE
UND
ELICITOREN
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
PFLANZENZELLEN
.
143
4.4.2
NACHWEIS
EINES
"CLUSTERING"
VON
ABP
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
VON
PROTOPLASTEN
AUS
MAISKOLEOPTILZELLEN
.
145
4.4.2.1
DEUTUNGSMOEGLICHKEITEN
EINER
LIGANDINDUZIERTEN
UMVERTEILUNG
DES
ABP
.
145
4.4.2.2.
CLUSTERBILDUNG
ALS
AUSDRUCK
DER
"INTRINSISCHEN"
AKTIVITAET
EINES
"ECHTEN"
REZEPTORS
.
147
4.4.3
SCHWIERIGKEITEN
BEI
DER
KONFORMATIONSBESTIMMUNG
DES
PLASMA
MEMBRANSTAENDIGEN
AUXINBINDUNGSPROTEINS
MITTELS
MAC
256
.
149
4.4.4
UNBEANTWORTETE
FRAGE
NACH
DER
INTERNALISIERUNG
VON
PLASMAMEMBRAN
GEBUNDENEN
REZEPTOR-LIGAND-KOMPLEXEN
IN
PFLANZEN
.
150
VN
4.4.5
BEREITSTELLUNG
EINES
ANTISERUMS
GEGEN
DIE
SCHWEREN
KETTEN
PFLANZLICHEN
CLATHRINS
FUER
ZUKUENFTIGE
FORSCHUNG
.
151
4.5
BETRACHTUNGEN
ZUR
SUBZELLULAEREN
REZEPTORVERTEILUNG
UND
ZELLPHYSIOLOGISCHEN
PRIMAERWIRKUNG
VON
ELICITOREN
BZW.
AUXINEN
.
151
4.6
PHYSIOLOGISCHE
ASPEKTE
ZUR
GEWEBSVERTEILUNG
DES
ABP
.
156
4.7
ANSATZPUNKTE
ZUKUENFTIGER
FORSCHUNGSPROJEKTE
.
157
5
ZUSAMMENFASSUNG.
.
160
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
162
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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