Partielle Charakterisierung Endothelin bindender Proteine:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1*
EINLEITUNG 1
2. AUF
GABENSTELLUNG 11
2*
EXPERIMENTELLER TEIL 12
3.1. MATERIAL
12
3.1.1. CHEMIKALIEN 12
3.1.2. VERBRAUCHSMITTEL 14
3.1.3. GERAETE 14
2*2.
METHODEN 16
3.2.1. INDUKTION EINER EXPERIMENTELLEN HERZINSUFFIZIENZ
16
IN KANINCHEN
3.2.2. PRAEPARATION VON ET-REZEPTOR-HALTIGEN FRAKTIONEN
16
3.2.2.1. HOMOGENAT VON KANINCHENGEWEBEN 16
3.2.2.2. SUBZELLULAERE FRAKTIONIERUNG MENSCHLICHER LEBER 17
3.2.2.3. PRAEPARATION MENSCHLICHER PLAZENTAMIKROSOMEN 18
3.2.2.4. SOLUBILISIERUNG VON ENDOTHELINREZEPTOREN 19
3.2.3. CHARAKTERISIERUNG DER ET-REZEPTOR-LIGAND-BINDUNG
19
3.2.3.1. KOMPETITIONS-BINDUNGSEXPERIMENTE 19
3.2.3.1.1 MEMBRANGEBUNDENE ET-REZEPTOREN 19
3.2.3.1.2 SOLUBILISIERTE ET-REZEPTOREN UND LOESLICHES ET-
BINDUNGSPROTEIN 21
3.2.3.2. SATURATIONS-BINDUNGSEXPERIMENTE MEMBRANGEBUN
DENER ET-L-REZEPTOREN 21
3.2.3.3. MESSUNG DER ASSOZIATION VON [
125I]ET-1 AN MEM
BRANGEBUNDENE ET-L-REZEPTOREN 21
3.2.3.4. MESSUNG DER DISSOZIATIONSREAKTION MEMBRAN
GEBUNDENER
[L25L]ET-L/ET-L-REZEPTORKOMPLEXE
21
3.2.4. ANALYTISCHE METHODEN 22
3.2.4.1
. MESSUNG SUBZELLULAERER LEITENZVME 22
3.2.4.1.1. LAKTAT DEHYDROGENASE 22
3.2.4.1.2. GLUKOSE-6-PHOSPHATASE 22
3.2.4.1.3. CYTOCHROM C OXIDASE 23
3.2.4.1.4. N-ACETYL-SS-D- HEXOSAMINIDASE 23
3.2.4.1.5 5'NUKLEOSIDASE 24
3-2A2,
SLULENCHROMATOGRAPHIE 24
3.2.4.2.I. GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE VON [125J] ET-
1/ET-L-REZEPTORKOMPLEXEN 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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N
3.2.4.2.1.1. BIO-GEL A 1,5 M 24
3.2.4.2.1.2 SEPHAROSE G-50 25
3.2.4.2.2. AFFINITAETCHROMATOGRAPHIE 25
3.2.4.2.2.1. ET-1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 25
3.2.4.2.2.2. CIBACRON-BLUE-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 26
3.2.4.2.2.3. CONCANAVALIN-A-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 26
3,?,.43- CHEMISCHE OUERVERNETZUNG VON R
125LLET-L MIT ET-
REZEPTOREN 26
3.2.4.3.1. MEMBRANGEBUNDENE ET-REZEPTOREN 26
3.2.4.3.2. SOLUBILISIERTE ET-L-REZEPTOREN UND LOESLICHES ET-
BINDUNGSPROTEIN 27
3.2.4.4. BESTIMMUNG VON IRET-L-KONZENTRATIONEN
27
3.2.4.4.1. PLASMAEXTRAKTION 27
3.2.4.4.2. BESTIMMUNG VON IMMUNOREAKTIVEN ET-L-KONZEN-
TRATIONEN IN GEWEBEHOMOGENATEN 27
3.2.4.4.3. HPLC-ANALYSE VON IMMUNOREAKTIVEM ET-1 AUS
GEWEBE 27
3.2.4.4.4. RADIOIMMUNOTEST 28
3.2.4.5. GELELEKTROPHORESE
29
3.2.4.5.1. SDS-PAGE 29
3.2.4.5.2. ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG IN RUNDGELEN 29
3.2.4.5.3. COOMASSIE-FAERBUNG 29
3.2.4.5.4. SILBER-FAERBUNG 30
3.2.4.5.5. NACHWEIS [
125I]ET-L-MARKIERTER PROTEINE IM SDS-
PAGE 30
3.2.4.5.6. WESTERN BLOT 30
3.2.4.6. PROTEINBESTIMMUNG
31
3.2.4.7. ANALYSE VON BINDUNGSDATEN
31
3.2.4.7.1. SATURATIONS- UND KOMPETITIONSBINDUNGSDATEN 31
3.2.4.7.2. BERECHNUNG DER KINETISCHEN ASSOZIATIONSKONSTANTE
K+I IMD KOB 31
3.2.4.73. BERECHNUNG DER KINETISCHEN DISSOZIATIONSKONSTANTE
K.I 34
3.2.4.7.4. BERECHNUNG DER HALBWERTSZEIT DER REAKTION AUS K_I 34
3.2.4.7.5. THERMODYNAMISCHE PARAMETER 35
3.2.4.7.5.I. GLEICHGEWICHTSTHERMODYNAMIK 35
3.2.4.73.2. TRANSITIONSTHERMODYNAMIK 35
3-2,4
3- STATISTIK 36
4* ER
GEBNISSE 37
M
4L
CHARAKTERISIERUNG VON ET-L-REZEPTOREN UND
PLASMA- UND GEWEBEKONZENTRATIONEN IN KANINCHEN
NACH INDUZIERTER HERZINSUFFIZIENZ 37
4.1.1. INDUZIERTE HERZINSUFFIZIENZ 37
4.1.1.1. EINFLUSS DER HERZINSUFFIZIENZ AUF DAS GEWICHT UND
DEN PROTEINGEHALT DER ORGANE 37
4.1.1.2. ET-1 KONZENTRATIONEN IN PLASMA UND GEWEBEN 38
4.1.1.3 EINFLUSS DER HERZINSUFFIZIENZ AUF DIE ET-L-
REZEPTOREN 40
2-
CHARAKTERISIERUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN ET-
REZEPTOREN IN MENSCHLICHEN GEWEBEN 44
4.2.1. ET-REZEPTOREN IN MENSCHLICHER LEBER 44
4.2.2. ET-L-REZEPTOREN IN MIKROSOMEN MENSCHLICHER
PLAZENTA 48
4.2.2.1. HOMOLOGE SATURATIONS- UND KOMPETITIONS-BIN-
DUNGSANALYSE DER ET-1 BINDUNG 48
4.2.2.2. HETEROLOGE KOMPETITIONS-BINDUNGSANALYSE DER ET-1
BINDUNG 50
4.2.3. EINFLUSS DIVALENTER KATIONEN AUF DIE BINDUNG VON
[125I]ET-1 51
4.2.3.1. EINFLUSS DIVALENTER KATIONEN AUF DIE [
125I]ET-1/ET-1-
REZEPTORBINDUNG IN ABHAENGIGKEIT DES PH-WERTES 51
4.2.3.2. EINFLUSS DIVALENTER KATIONEN AUF BMAX UND KD DER 52
BINDUNG VON [
125I]ET-1
4.2.3.3. EINFLUSS DIVALENTER KATIONEN AUF DAS APPARENTE 53
MOLEKULARGEWICHT DER ET-L-REZEPTOREN
4.2.3.3.1. CROSS-LINK-EXPERIMENTE 53
4.2.3.3.2. GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 54
4.2.4. ASSOZIATION VON [
12^I]ET-1 AN ET-L-REZEPTOREN 56
4.2.4.1. EINFLUSS VON PH UND TEMPERATUR AUF DIE BEOBACH
TETE ASSOZIATIONSKONSTANTE KOB IN GEGENWART DIVA
LENTER KATIONEN 58
4.2.4.2. BESTIMMUNG DER GLEICHGEWICHTS-DISSOZIATIONS
KONSTANTE
KD AUS DER LIGANDENKONZENTRATIONSAB
HAENGIGKEIT DER BEOBACHTETEN ASSOZIATIONSKONSTANTE
KOB 59
4.2.5. TEMPERATUR- UND PH-ABHAENGIGKEIT DER GLEICHGE
WICHTSDISSOZIATION IN AN- UND ABWESENHEIT DIVA
LENTER KATIONEN 60
IV
4.2.6.
4.2.7.
4.2.8.
4.2.9.
4.2.10.
4.3.
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.3.1.
4.3.3.2.
4.3.3.2.1.
4.3.3.2.2.
4.3.3.2.3.
4.3.4.
4.3.5.
4.3.6.
4.3.6.1.
4.3.6.2.
4.3.6.2.I.
4.3.6.2.2.
5
*
5.1.
5.2
DISSOZIATION DER [LI]ET-L/ET-L-REZEPTORKOMPLEXE
IM PRAEAEQUILIBRIUM
HYPOTHETISCHES MODELL FUER DIE REAKTION VON
[125J]ET-I MIT ET-L-REZEPTOREN IN GEGENWART DIVA
LENTER KATIONEN
UNTERSUCHUNGEN DER BEDEUTUNG FREIER SH-GRUPPEN
UND DISULFIDBRUECKEN DER EXTRAZELLULAEREN DOMAENE
DER ET-L-REZEPTOREN FUER DEN HOCHAFFINEN BINDUNGS
ZUSTAND DES [
125I]ET-1 /ET-1-REZEPTORKOMPLEXES
GLEICHGEWICHTSTHERMODYNAMIK DER [125I]ET-1/ET-1-
REZEPTORBINDUNG
TRANSITIONSTHERMODYNAMIK
PARTIELLE CHARAKTERISIERUNG EINES LOESLICHEN ETI
BINDUNGSPROTEINS AUS BLUTPLASMA
CROSS-LINK-STUDIEN
KOMPETITIONS-BINDUNGEXPERIMENTE
REINIGUNG DES ET-BINDUNGSPROTEINS
GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
ET-L-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
CONCANAVALIN-A-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
CIBACRON-BLUE-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
PROTEINSEQUENZIERUNG
KONZENTRATION DES ET-BINDUNGSPROTEINS UNTER
PATHOLOGISCHEN BEDINGUNGEN
HIRNBLUTUNG
BLUTHOCHDRUCK
EINFLUSS DES BLUTDRUCKS AUF DIE KONZENTRATION DES
ET-BINDUNGSPROTEINS IM PLASMA NORMOTENSIVER
UND HYPERTENSIVER RATTEN
EINFLUSS VON CYCLOSPORIN AUF DIE KONZENTRATION DES
ET-BINDUNGSPROTEINS IM PLASMA VON PINSELAEFFCHEN
DISKUSSION
INDUZIERTE HERZINSUFFIZIENZ IN KANINCHEN
SUBZELLULAERE VERTEILUNG VON ET-1, ET-2 UND ET-3
REZEPTOREN IN HUMANER LEBER
63
67
67
68
75
79
79
83
83
83
84
84
86
86
87
88
88
88
90
90
90
92
92
95
DER [
125I]ET-1/ET-1-REZEPTORKOMPLEX IN MENSCH
LICHEN PLAZENTAMIKROSOMEN: MOLEKULARE, KINE
TISCHE UND THERMODYNAMISCHE EIGENSCHAFTEN IN AN-
UND ABWESENHEIT DIVALENTER KATIONEN
ET-L-BINDUNGSPROTEIN
ZUSAMMENFASSUNG
LITERATUR |
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