Charakterisierung des neuronalen und rekombinanten AMPA-Kainat-Rezeptors und Identifizierung zweier Untereinheiten-spezifischer Antagonisten des Rezeptors:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
NERVENZELLEN
1
1.2.
BEDEUTUNG
DES
HIPPOCAMPUS
3
1.3.
NEURONALER
GLUTAMAT
-
REZEPTOR
5
1.4.
REKOMBINANTER
GLUTAMAT
-
REZEPTOR
12
1.5.
ROLLE
DES
GLUTAMAT
-
REZEPTORS
BEI
NEURODEGENERATIVEN
ERKRANKUNGEN
19
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
22
2.1.
EXPERIMENTE
IM
GEHIMSCHNITT
22
2.1.1.
PRAEPARATION
UND
AUFBEWAHRUNG
DER
GEHIMSCHNITTE
22
2.1.2.
MESSKAMMER
24
2.1.3.
MIKROSKOP
25
2.1.4.
MESSSTAND
26
2.1.5.
ELEKTRONIK
DES
MESSSTANDES
27
2.1.6.
HERSTELLUNG
DER
PFLFCH-PIPETTEN
UND
REINIGUNGS
(CLEANING)
PIPETTEN
27
2.1.7.
PATCH-CLAMP
TECHNIK
28
2.1.8.
PATCH-CLAMP
IM
GEHIMSCHNITT
(SLICE)
30
2.2.
MOLEKULARBIOLOGIE
32
2.2.1.
MIKROORGANISMEN,
PLASMIDE
32
2.2.2.
NAEHRMEDIEN
UND
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
33
2.2.3.
ERNTE
DER
ZELLEN
33
2.2.4.
PLASMIDPRAEPARATION
33
2.2.5.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
36
2.2.6.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
37
2.2.7.
LANGZEITHALTUNG
DER
BAKTERIENSTAEMME
38
2.2.8.
NACHWEIS
UND
AUFTRENNUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
38
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.9.
BESTIMMUNG
DER
DNA-KONZENTRATION
UND
DNA-LAENGENSTANDARDS
40
2.2.10.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
41
2.2.11.
LIGATION
42
2.2.12.
HERSTELLUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
44
2.2.13.
HERSTELLUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
46
2.2.14.
"OLIGONUCLEOTIDE
SITE
DIRECTED
MUTAGENESIS
"
46
2.2.15.
SYNTHESE
DER
RNA
52
2.2.16.
SEQUENZIERUNG
DER
DNA
55
2.2.17.
"POLYMERASE
CHAIN
REACTION"
(PCR)
58
2.2.18.
RESTRIKTIONSVERDAU
60
2.3.
OOZYTEN
EXPRESSIONSSYSTEM
61
2.3.1.
OPERATION
DER
KRALLENFROESCHE
(XENOPUS
LAEVIS)
61
2.3.2.
SKINNEN
DER
OOZYTEN
62
2.3.3.
VORBEREITUNG
DER
RNA-LOESUNG
UND
HERSTELLUNG
DER
INJEKTIONSPIPETTEN
63
2.3.4.
INJEKTION
DER
RNA
63
2.3.5.
EXPRESSION
DER
GLUTAMAT-KANAELE
64
2.3.6.
ZUSAMMENSETZUNG
DES
OOZYTEN-MESSPLATZES
65
2.3.7.
INTRAZELLULAERE
ELEKTRODEN
65
2.3.8.
MESSKAMMER
66
2.3.9.
"ZWEI
ELEKTRODEN
SPANNUNGSKLEMME"
(TWO
ELECTRODE
VOLTAGE
CLAMP)
66
2.3.10.
DATENANALYSE
67
3.
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
68
3.1.
EXPERIMENTE
IN
HIPPOCAMPUS
-
GEHIMSCHNITTEN
68
3.1.1.
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
68
3.1.2.
KAINAT
UND
AMPA
ALS
AGONISTEN
DES
AMPA/KAINAT-REZEPTORS
IM
HIPPOCAMPUS
DER
RATTE
72
3.1.3.
AUFNAHME
VON
DOSIS-WIRKUNGSKURVEN
FUER
KAINAT
UND
AMPA
IN
KOEMERZELLEN,
CAI
UND
CA3-PYRAMIDENZELLEN
DES
HIPPOCAMPUS
76
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4.
STROM-SPANNUNGSBEZIEHUNG
DES
KAINAT-INDUZIERTEN
STROMES
IN
ZELLEN
DES
HIPPOCAMPUS
79
3.1.5.
VERGLEICH
DER
STROMAMPLITUDEN
DURCH
DIE
APPLIKATION
VON
GERINGEN
AMPA
-
UND
KAINAT
-
KONZENTRATIONEN
81
3.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
AMPA/KAINAT-REZEPTOREN
IM
OOZYTEN-EXPRESSIONSYSTEM
85
3.2.1.
DURCHFUEHRUNG
EINER
STROMMESSUNG
AN
EINER
OOZYTE
IN
DER
"ZWEI
ELEKTRODEN
SPANNUNGSKLEMME"
85
3.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
AUS
VERSCHIEDENEN
UNTEREINHEITEN
ZUSAMMENGESETZTEN
AMPA/KAINAT-REZEPTOREN
HINSICHTLICH
DER
DOSIS-WIRKUNGSBEZIEHUNG
DES
AGONISTEN
88
3.2.3.
VERGLEICH
DER
REKOMBINANTEN
REZEPTOREN
HINSICHTLICH
IHRER
STROM-SPANNUNGSBEZIEHUNG
91
3.3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
SPEZIFISCHEN
ANTAGONISTEN
DER
AMPA/KAINAT-REZEPTOREN
93
3.3.1.
UNTEREINHEITEN
-
SPEZIFISCHER
BLOCK
DURCH
EVANS
BLAU
AUF
KAINAT-INDUZIERTE
STROEME
DES
AMPA/KAINAT-REZEPTORS
93
3.3.I.I.
STROMVERGROESSERUNG
DURCH
EVANS
BLAU
IN
MIKROMOLAREN
KONZENTRATIONEN
93
3.3.I.2.
BLOCKADE
DES
KAINAT-INDUZIERTEN
STROMES
DURCH
NANOMOLARE
KONZENTRATIONEN
VON
EVANS
BLAU
95
3.3.I.3.
SPEZIFITAET
DES
EVANS
BLAU
-
BLOCKES
98
3.3.I.4.
NICHT
KOMPETITIVER
EVANS
BLAU
-
BLOCK
99
3.3.I.6.
UNTEREINHEITEN-SPEZIFISCHER
EVANS
BLAU
-
BLOCK
101
3.3.2.
UNTEREINHEITEN-SPEZIFISCHER
BLOCK
DURCH
JSTX
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
BINDUNGSSTELLE
IN
DER
KANALPORE
103
3.3.2.I.
JSTX
-
BLOCK
DES
KAINAT-INDUZIERTEN
STROMES
AUF
AMPA/KAINAT-REZEPTOREN
EXPRIMIERT
IN
OOZYTEN
103
3.3.2.2.
MECHANISMUS
DES
JSTX
-
BLOCKES
106
3.3.2.3.
UNTEREINHEITEN-SPEZIFISCHER
BLOCK
DURCH
JSTX
UND
KORRELATION
ZUR
STROM-SPANNUNGSBEZIEHUNG
107
3.3.2.5.
IDENTIFIKATION
DER
FUER
DEN
JSTX
-
BLOCK
VERANTWORTLICHEN
AMINOSAEURE
DURCH
SINGLE
POINT
MUTANTS
111
INHALTSVERZEICHNIS
4.
DISKUSSION
115
4.1.
EIGENSCHAFTEN
DER
AMPA/KAINAT-REZEPTOREN
IN
KOEMERZELLEN,
CAI
UND
CA3-NEURONEN
IM
HIPPOCAMPUS-GEWEBESCHNITT
115
4.2.
VERGLEICH
DER
AMPA/KAINAT
REZEPTOREN
IN
DEN
KOEMERZELLEN,
CAI
UND
CA3
NEURONEN
DES
HIPPOCAMPUS
119
4.3.
VERGLEICH
DES
NEURONALEN
AMPA/KAINAT-REZEPTORS
MIT
DEM
REKOMBINANTEN
AMPA/KAINAT-REZEPTOR
122
4.4.
UNTEREINHEITEN-SPEZIFISCHE
ANTAGONISTEN
DES
AMPA/KAINAT-REZEPTORS
125
4.4.1.
EVANS
BLAU
ALS
UNTEREINHEITEN-SPEZIFISCHER
BLOCKER
DES
AMPA/KAINAT
REZEPTORS
125
4.4.2.
BLOCKIERUNG
DER
LINEAREN
AMPA/KAINAT
REZEPTOREN
DURCH
JSTX
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
JSTX-BINDUNGSSTELLE
126
5.
ZUSAMMENFASSUNG
131
6.
LITERATURVERZEICHNIS
134
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF |
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