Reinigung, Charakterisierung und Untersuchungen zur Funktion der plasmamembrangebundenen Nitratreduktase von Chlorella saccharophila:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
2
MATERIAL
UND
METHODEN
2.1
PFLANZENMATERIAL
UND
KULTURBEDINGUNGEN
.
6
2.1.1
KULTURBEDINGUNGEN
FUER
CHLORELLA
SACCHAROPHILA
.
6
2.1.2
KULTURBEDINGUNGEN
FUER
CHLORELLA
SOROKINIANA
.
6
2.2
PRAEPARATION
DER
MIKROSOMALEN
FRAKTION
.
7
2.2.1
PRAEPARATION
UND
AUFBRUCH
VON
PROTOPLASTEN
.
7
2.2.2
PRAEPARATION
DER
ZELLFREIEN
EXTRAKTE
.
9
2.3
ANREICHERUNG
DER
LOESLICHEN
NITRATREDUKTASE.
_
10
2.4
PLASMAMEMBRANPRAEPARATION
.
11
2.5
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAETEN
.
14
2.5.1
NITRATREDUKTASE
IN
VITRO
.
14
2.5.2
NITRATREDUKTASE IN
SITU
.
17
2.5.3
K+
-ABHAENGIGE
,
MG
2+
-STIMULIERBARE
ATPASE.
18
2.5.4
NITRITREDUKTASE
.
19
2.5.5
GLUTAMINSYNTHETASE
.
20
2.5.6
GLUTAMATDEHYDROGENASE
.
21
2.6
TEMPERATURINDUZIERTE
PHASENVERTEILUNG
IM
TRITON
X-114-SYSTEM
.
21
2.7
CHROMATOGRAPHISCHE
VERFAHREN
.
22
2.7.1
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
22
2.7.2
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE.
22
2.7.3
GELFILTRATION
.
23
2.8
GELELEKTROPHORETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
24
2.8.1
SDS-PAGE
.
24
2.8.2
WESTERN-BLOTTING
UND
IMMUNDETEKTION
.
27
2.8.3
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
29
2.8.4
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
.
29
2.8.5
NACHWEIS
GLYKOSYLIERTER
PROTEINE
.
31
2.9
PRAEPARATION
VON
IGG-FRAGMENTEN
.
32
2.10
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHOSPHORYLIERUNG
VON
PLASMAMEMBRANPROTEINEN
.
33
2.11
MARKIERUNG
VON
PLASMAMEMBRANPROTEINEN
MIT
3
H-ETHANOLAMIN
.
34
2.12
BEHANDLUNG
VON
PLASMAMEMBRANEN
MIT
DER
PHOS
PHOINOSITOLSPEZIFISCHEN
PHOSPHOLIPASE
C
.
35
2.13
PROTEINBESTIMMUNG
.
35
2.14
MESSUNG DER
NITRATAUFNAHME
.
36
2.15
CHLOROPHYL
IBESTIMMUNG
.
37
3
ERGEBNISSE
3.1
REINIGUNG
DER
PLASMAMEMBRANGEBUNDENEN
NITRATREDUKTASE
.
38
3.1.1
VERTEILUNG DER
NR-AKTIVITAET
IN
DEN
ZELLFRAKTIONEN
.
38
3.1.2
NACHWEIS
DER
PM-NR
IM
WESTERNBLOT
IN
AB
HAENGIGKEIT
VON
DER ORIENTIERUNG
DER
PLASMAMEMBRANVESIKEL
.
39
3.1.3
TRENNUNG
DER
PM-NR
VON DER
LOESLICHEN
NR
41
3.1.4
REINIGUNG
DER
PM-NR
UEBER
DIE
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
42
3.2
EINFLUSS
UNTERSCHIEDLICHER
PARAMETER
AUF
DIE
AKTIVITAET
VON
PLASMAMEMBRANGEBUNDENER
UND
LOESLICHER
NITRATREDUKTASE
.
45
3.2.1
EINFLUSS
VON
DETERGENTIEN
UND
PHOSPHOLIPIDEN
.
45
3.2.2
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
NR-PARTIALREAKTIONEN
.
47
3.2.3
PH-ABHAENGIGKEIT
.
49
3.2.4
NADH/NADPH-ABHAENGIGKEIT
.
50
3.2.5
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
SUBSTRATKONZENTRATION
.
50
3.3
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTES
VON
PLASMAMEMBRANGEBUNDENER
UND
LOESLICHER
NITRATREDUKTASE
.
52
3.3.1
MOLEKULARGEWICHTE
DER
UNTEREINHEITEN
DER
NR
NACH DER
SDS-PAGE
.
52
3.3.2
MOLEKULARGEWICHTE
DER NATIVEN
NR-FORMEN.
54
3.4
UNTERSUCHUNG
VON
ISOFORMEN
DER
NITRATREDUKTASE
55
3.4.1
ISOFORMEN
AUFGRUND
VON
UNTERSCHIEDEN
IM
HYDROPHOBEN
VERHALTEN
.
55
3.4.2
VERHALTEN
VON LADUNGSISOMEREN
BEI
DER
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
60
3.4.3
KOMBINATION
DER
HYDROPHOBEN
INTERAKTIONS
UND
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
63
3.4.4
UNTERSUCHUNG
VON
LADUNGSISOMEREN
DER
NATIVEN
NR-FORMEN
MIT
DER
ISOELEKTRISCHEN
FOKUSSIERUNG
.
65
3.4.5
UNTERSUCHUNG
VON
LADUNGSISOMEREN MIT
DER
ZWEIDIMENSIONALEN
GELELEKTROPHORESE
.
66
3.5
HINWEISE
AUF
EINE
GLYKOSYLIERUNG
DER PLASMA
MEMBRANGEBUNDENEN
UND
DER
LOESLICHEN
NITRATREDUKTASE
.
67
3.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNG
DER
NITRATREDUKTASE
AN DIE
PLASMAMEMBRAN
UEBER
EINEN
GLYKOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL-ANKER
.
69
3.7
PHOSPHORYLIERUNG
VON
PLASMAMEMBRANPROTEINEN
UNTER
VERSCHIEDENEN
BEDINGUNGEN
.
74
3.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BETEILIGUNG DER PLASMA
MEMBRANGEBUNDENEN
NITRATREDUKTASE
AN
DER
BLAULICHTSTIMULIERUNG
DER
NITRATAUFNAHME
.
78
3.9
DER
EINFLUSS VON
SACCHAROSE
ODER
ANAEROBIS
AUF
WACHSTUM
UND
NITRATREDUKTASEAKTIVITAET
.
90
3.9.1
BEDEUTUNG
VON
SACCHAROSE
.
90
3.9.2
BEDEUTUNG VON
AEROBEN/ANAEROBEN
BEDINGUNGEN
.
91
4
DISKUSSION
4.1
EINE
PLASMAMEMBRANGEBUNDENE
NITRATREDUKTASE
EXISTIERT
.
94
4.2
VERGLEICH
DER
PLASMAMEMBRANGEBUNDENEN
UND
DER
LOESLICHEN
NITRATREDUKTASE
.
97
4.2.1
UNTERSCHIEDE
IM
HYDROPHOBEN
VERHALTEN.
98
4.2.2
SUCHE
NACH
LADUNGSISOMEREN
.
100
4.2.3
UNTERSCHIEDE
IN
DER
AFFINITAET
ZU
NITRAT
106
4.2.4
MOLEKULARGEWICHT DER
NITRAT
REDUKTASEFORMEN
.
106
4.2.5
GLYKOSYLIERUNG DER
NITRATREDUKTASEFORMEN
110
4.2.6
PM-NR
UND
LOESLICHE
NR
BEI
ERNAEHRUNG
MIT
AMMONIUM
.
112
4.3
IST
DIE
PM-NR
AUS
CHLORELLA
UEBER
GLYKOSYLPHOS
PHATIDYLINOSITOL
IN
DER
PLASMAMEMBRAN
VERANKERT?
.
115
4.4
EXISTIERT
EINE
TRANSMEMBRANE
SIGNALKETTE
FUER
DIE
BLAULICHTSTIMULIERUNG
DER
NITRATAUFNAHME?
122
5
ZUSAMMENFASSUNG
140
6
ANHANG
6.1
PHYSIOLOGISCHE
BESONDERHEITEN
VON
CHLORELLA
SACCHAROPHILA
.142
6.2
GIBT
ES
HINWEISE
AUF
EINE
DISSIMILATORISCHE
FUNKTION
DER
PM-NR?
.
144
7
LITERATURVERZEICHNIS
147 |
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