Bovines Herpesvirus Typ 4 (BHV-4): Untersuchungen zur Eignung als Vektorsystem und zum Replikationsprozess:
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1994
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INHALT
5
C
O
W
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W
C
O
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O
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O
W
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O
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A
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I-
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*
TOI-*
INHALT
1
EINLEITUNG
9
2
MATERIALIEN
19
BEZUGSQUELLENNACHWEIS
19
ANTIBIOTIKA,
CHEMIKALIEN,
ENZYME,
KITS
19
SONSTIGE
VERBRAUCHSMATERIALIEN
20
PLASMIDE,
BAKTERIENSTAEMME
UND
ZELLINIEN
21
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
21
KULTURMEDIEN
21
LOESUNGEN
UND
PUFFER
23
METHODEN
29
ZELLKULTURHALTUNG
UND
VIRUSANZUCHT
29
ZELLKULTUREN
29
VIRUSANZUCHT
29
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
VIRIONEN
30
DNA-TRANSFER
IN
EUKARYOTE
ZELLEN
/
ELEKTROPORATION
31
TRANSIENTE
EXPRESSION
33
SS-GALAKTOSIDASE-NACHWEIS
DURCH
FIXIERUNG
UND
FAERBUNG
33
LUCIFERASE-ASSAY
34
HOMOLOGE
REKOMBINATION
34
LEBENDFARBUNG
UND
PLAQUEREINIGUNG
35
REPLIKATIONSASSAY:
ORI-KARTIERUNG
NACH
HAMZEH
ET
AL.
37
REPLIKATIONSASSAY:
ORI-KARTIERUNG
UEBER
TRANS-KOMPLEMENTATION
39
DNA-ISOLIERUNG
NACH
HIRT
40
AMPLIFIZIERUNG
UND
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
41
TRANSFORMATION
NACH
HANAHAN,
MODIFIZIERT
41
PLASMIDPRAEPARATIONEN
42
TECHNIKEN
ZUR
ANALYSE
UND
KLONIERUNG
ISOLIERTER
DNA
44
RESTRIKTIONSANALYSE
44
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
45
ELUTIONSTECHNIKEN
46
LIGATIONSTECHNIKEN
48
SOUTHERN
TRANSFER
50
RANDOM
PRIMING
(
MIT
A^P
DCTP
ODER
DIG
DUTP)
52
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG,
RADIOAKTIV
53
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG,
NICHT
RADIOAKTIV
53
ANALYSE
DER
REPLIKATIONSASSAYS
55
AUSWERTUNG
DER
DHPG-ASSAYS
55
DPN
I-ASSAY
56
6
INHALT
4
ERGEBNISSE
59
4.1
HERSTELLUNG
EINES
REKOMBINANTEN
VIRUS
59
4.1.1
ERSTE
REKOMBINATION:
KONSTRUKTION
DER
PLASMIDE
61
4.1.2
REKOMBINATION
UND
OPTIMIERUNG
DER
PLAQUEREINIGUNGSTECHNIK
68
4.1.3
ANREICHERUNG
UND
STABILITAETSTESTS
71
4.1.4
ZWEITE
REKOMBINATION:
INSERTION
DES
ZUC-GENS
77
4.2
KARTIERUNG
DES
REPLIKATIONSSTARTPUNKTES
(ORI)
88
4.2.1
METHODE
NACH
HAMZEH
ET
AL.
89
4.2.2
TRANS
KOMPLEMENTATION
UND
DPNI-ASSAY
94
4.2.3
FUNKTIONSTEST
DER
IN
CIS
ERFORDERLICHEN
ELEMENTE
104
5
DISKUSSION
107
5.1
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BHV-4-GENOME
109
5.1.1
WAHL
DER
MARKERGENE
109
5.1.2
ASPEKTE
DER
METHODIK
111
5.1.3
WAHL
DER
INSERTIONSORTE
UND
STABILITAET
DER
REKOMBINANTEN
ERSTER
GENERATION
115
5.1.4
DIE
ZUC-INSERTION:
NACHWEIS
DER
ANWENDBARKEIT
DES
VEKTORS
(REKOMBINANTEN
ZWEITER
GENERATION)
118
5.2
LOKALISIERUNG
EINES
REPLIKATIONSSTARTPUNKTES
119
5.2.1
DHPG
FUEHRT
ZUR
REDUKTION
DER
VIRALEN
DNA-SYNTHESE
121
5.2.2
ETABLIERUNG
EINES
DPNI-ASSAYS
OHNE
VERWENDUNG
VON
RADIONUKLEOTIDEN
123
5.3
TEST
DER
IN
CIS
ERFORDERLICHEN
ELEMENTE
ZUR
HERSTELLUNG
EINES
DELETIONSVEKTORS
125
5.4
AUSBLICK
126
6
ZUSAMMENFASSUNG
/
SUMMARY
128
ANHANG
131
A
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
132
B
LITERATUR
134
C
DANKSAGUNG
143
D
LEBENSLAUF
144 |
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