Untersuchungen zur Regulation der Transkription von HIV-1 in chronisch infizierten Gliazellen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 1994 |
| Beschreibung: | IV, 225 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
1
1.
SCHRIFTTUM
2
1.1.
VIROLOGISCHE
GRUNDLAGEN
DER
HIV
1
INFEKTION
2
1.1.1.
KLASSIFIZIERUNG
2
1.1.2.
VERMEHRUNG
UND
MORPHOGENESE
2
1.1.3.
GENOM
UND
STRUKTURPROTEINE
4
1.1.4.
REGULATORISCHE
PROTEINE
DES
HIV
6
L.II.
DIE
HIV-INFEKTION
DES
GEHIRNS
10
1
.HI.
MOLEKULARE
MECHANISMEN
DER
LATENZ
BEI
HIV
12
L.IV.
DER
LTR
DES
HIV
13
1.
IV.
1.
AUFBAU
DES
HIV-LTRS
16
1
.IV.
1.1.
MODULATORISCHES
ELEMENT
16
1
.IV.
1.2.
TRANSKRIPTIONELLE
KEMELEMENTE
24
1
.IV.
1.3.
DAS
TAR-ELEMENT
26
1
.V.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
28
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
29
2.1.
MATERIAL
29
2.1.1.
REAGENZIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
29
2.1.2.
REAGENZIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
ZELLKULTURTECHNISCHE
METHODEN
UND
PROTEINANALYTIK
30
2.1.3.
BAKTERIEN
UND
PLASMIDE
31
2.1.4.
ZELLMATERIAL
33
2.1.5.
COMPUTERPROGRAMME
35
2.H.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
36
2.H.I.
PLASMIDISOLIERUNG
36
2.H.L1.
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
(CSCL-GRADIENT)
36
2.H.I.2.
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG
NACH
KOCHEN
DER
ZELLEN
IN
STET-PUFFER
38
2.H.2.
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
VON
DNS
IN
WAESSRIGER
LOESUNG
38
2.H.3.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
39
2.H.4.
ABSCHAETZUNG
DER
DNS-MENGE
39
2.H.5.
GROESSENBESTIMMUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
IM
AGAROSEGEL
40
2.H.6.
REINIGUNG
VON
DNS
40
2.H.6.
1.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
40
2.II.6.2.
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
VON
DNS
41
2.H.7.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
AN
DNS-MOLEKUELEN
41
2.H.7.
1.
SPALTUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
41
2.H.7.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
41
2.H.7.3.
KLENOW-BEHANDLUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
ZUR
AUFFUELLUNG
UEBERHAENGENDER
ENDEN
42
2.H.7.4.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
T4-POLYNUKLEOTID-KINASE
42
2.H.7.5.
VERKNUEPFUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
T4-DNS-LIGASE
43
2.H.8.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
43
2.H.8.
1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
43
2.H.8.2.
TRANSFORMATION,
PHAENOTYPISCHE
EXPRESSION
UND
SELEKTION
45
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.UE.9.
HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
45
2.UE.10.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MITTELS
T4-POLYNUKLEOTID-KINASE
45
2.H.11.
DNS-SEQUENZANALYSE
DURCH
DIE
ENZYMATISCHE
KETTENABBRUCHMETHODE
46
2.II.12.
POLYMERASE-CHAIN-REACTION
(PCR)
47
2.HI.
TECHNIKEN
IN
DER
ZELLKULTUR
49
2.HL
1.
ALLGEMEINE
ZELLKULTURTECHNIKEN
49
2.III.2.
UNTERSUCHUNGEN
AUF
MYKOPLASMENKONTAMINATION
50
2.IH.3.
INDIREKTE
IMMUN-PEROXIDASEFAERBUNG
(IPF)
50
2.IH4.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
MITTELS
ELEKTROPORATION
51
2.HI.5.
STABILE
TRANSFEKTION
MITTELS
ELEKTROPORATION
52
2.IUE.6.
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
53
2.III.6.1.
FUER
CAT-ASSAYS
53
2.III.6.2.
FUER
IMMUNOBLOTS
53
2.III.7.
HERSTELLUNG
VON
KEMEXTRAKTEN
FUER
GEL-RETENTIONSVERSUCHE
54
2.IV.
PROTEINBESTIMMUNG
VON
ZELL
UND
KEMEXTRAKTEN
-
55
2.V.
ERMITTLUNG
VON
VERSCHIEDENEN
REPORTERGEN-AKTIVITAETEN
55
2.V.
1.
ERMITTLUNG
DER
CHLORAMPHENICOL-ACETYL-TRANSFERASE-AKTIVITAET
55
2.V.2.
SS-GALAKTOSIDASE-FAERBUNG
56
2.V.3.
HGH-ELISA
57
2.V.4.
ALKALISCHE
PHOSPHATASE-BESTIMMUNG
(SEAP-ASSAY)
57
2.
VI.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
58
2.VI.1.
PROBENVORBEREITUNG
58
2.VI.2.
GELELEKTROPHORESE
58
2.
VII.
IMMUNOBLOT
59
2.
VII.
1.
PROTEINTRANSFER
AUF
NITROCELLULOSE-MEMBRANEN
59
2.VUE.2.
ECL-REAKTION/
IMMUNFAERBUNG
60
2.VIH
GEL-RETENTIONS-ANALYSE
60
3.
ERGEBNISSE
62
3.1.
HIV-L-LTR-CAT-REPORTERGENKONSTRUKTE
62
3.1.1.
SEQUENZIERUNG
UND
RESTRIKTIONSANALYSE
DER
BEIDEN
VEKTOREN
PHTV-L-LTR-CATUNDPHTV-L-ANRE-LTR-CAT
62
3.1.2.
UMKLONIERUNG
DER
HIV-L-LTR-FRAGMENTE
IN
DEN
PUCCAT-VEKTOR
63
3.1.3.
KONSTRUKTION
DER
PSBL-VEKTOREN
PNE/ANRE-CAT,
PANE/LTR-CAT
UND
PNE/ALTRCAT
66
3.II.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
68
3.II.
1.
OPTIMIERUNG
DER
TRANSFEKTIONSBEDINGUNGEN
68
3.11.1.1.
OPTIMIERUNG
DER
ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN
68
3
.II.
1.2.
EINFLUSS
DER
INKUBATIONSDAUER
BEI
4C
69
3.II.
1.3.
EINFLUSS
DER
EINGESETZTEN
PLASMIDMENGE
70
3.II.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ERMITTLUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
70
3.11.2.1.
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASE
71
3.II.2.2.
HGH-BESTIMMUNG
71
3.II.2.3.
BESTIMMUNG
DER
ALKALISCHEN
PHOSPHATASE
72
3.II.2.4.
VERWENDUNG
DES
PSV2-CAT-VEKTORS
73
3.HI.
NACHWEIS
DER
FUNKTIONALITAET
DES
PROVIRUS-KODIERTEN
TAT-PROTEINS
IN
INFIZIERTEN
GLIAZELLEN
TH4-7-5
74
3.IV.
VERSUCHE,
STABILE
NEF-TRANSFEKTANTEN
ZU
ETABLIEREN
78
3.V.
NEGATIVE
REGULATION
DER
HTV-L-LTR-AKTIVITAET
EINFLUSS
EINER
NEF
TEILSEQUENZ
AUSSERHALB
DES
LTRS
79
3.V.A.
UNTERSUCHUNG
DER
VERSCHIEDENEN
LTR-CAT-KONSTRUKTE
IN
GLIAZELLEN
UND
FIBROBLASTEN:
REGULATORISCHE
WIRKUNG
DER
NE/-TEILSEQUENZ
79
3.V.A.L.TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVITAET
EINES
PNE/-LTR-CAT-KONSTRUKTES
INHALTSVERZEICHNIS
III
IN
DEN
INFIZIERTEN
GLIAZELLEN
79
3.V.A.2.
EINFLUSS
DER
NRE-REGION
AUF
DIE
HIV-L-LTR-AKTIVITAET
3.V.A.2.A.
IN
ABWESENHEIT
DER
NTS
86
3.V.A.2.B.
IN
GEGENWART
DER
NTS
92
3.V.A.3.
EINFLUSS
DER
NTS
AUF
DEN
GESAMTEN
LTR
99
3.V.A.4.
EINFLUSS
DER
NTS
AUF
DEN
DELETIERTEN
LTR
105
3.V.B.
EINFLUSS
DER
NEF-TEILSEQUENZ
(NTS)
IN
TRANS
AUF
DIE
LTR
PROMOTORAKTIVITAET
112
3.
V.B.
1.
EINFLUSS
DER
NTS
IN
TRANS
AUF
DEN
GESAMTEN
UND
DELETIERTEN
LTR
112
3.V.B.2.
KONZENTRATIONSABHAENGIGE
WIRKUNG
DER
NTS
115
3.V.B.3.
EINFLUSS
DER
NTS
AUF
DEN
INTEGRIERTEN
LTR
IN
HELA-ZELLEN
117
3.V.B.4.
EINFLUSS
DER
NTS
AUF
DEN
SV40-PROMOTOR
118
3.V.C.
NACHWEIS
DER
REGULATORISCHEN
FUNKTION
DER
NTS
AUF
DNS-EBENE
119
3.
VI.
UNTERSUCHUNGEN
ZU
PROTEINBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
NTS
120
3.VI.1.
SUCHE
NACH
DNS-BINDENDEN
PROTEINEN
UNTER
VERWENDUNG
DER
GESAMTEN
NTS
120
3.
VI.
1.1.
AMPLIFIZIERUNG
DER
NTS
AUS
PNE/-LTR-CAT
MITTELS
PCR
120
3.VL1.2.
GEL-SHIFT-VERSUCHE
MIT
DER
GESAMTEN
NTS
121
3.VI.2.
UNTERSUCHUNG
DER
VERSCHIEDENEN
TEILBEREICHE
DES
NTS-FRAGMENTES
AUF
PROTEINBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
124
3.VI.2.1.
AUSWAHL
DER
VERSCHIEDENEN
TEILBEREICHE
DER
NTS
124
3.VI.2.2.
UNTERSUCHUNG
DER
PROTEINBINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DER
VERSCHIEDENEN
OLIGONUKLEOTIDPAARE
IN
DEN
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
125
4.
DISKUSSION
131
4.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ERMITTLUNG
DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ
131
4.N.
MOEGLICHE
URSACHEN
FUER
SCHWANKUNGEN
IN
ERGEBNISSEN
LOGARITHMISCHE
DARSTELLUNG/STATISTISCHE
AUSWERTUNG
133
4.M.
NACHWEIS
DER
FUNKTIONALITAET
DES
TAT-PROTEINS
135
4.IV.
DIE
NRE-REGION
ZEIGT
KEINEN
NEGATIV
REGULATORISCHEN
EFFEKT
137
4.V.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REGULATORISCHEN
FUNKTION
EINER
150
BP-SEQUENZ
AUSSERHALB
DESLTRS(NTS)
138
4.
V.
1.
NEGATIV
REGULATORISCHER
EFFEKT
DER
NTS-REGION
138
4.V.2.
ROLLE
DER
NRE-REGION
BEI
DER
NEGATIVEN
REGULATION
DURCH
NTS
139
4.V.3.
DIE
NTS
IST
EIN
TRANSAKTIVES
ELEMENT
141
4.V.4.
KONZENTRATIONSABHAENGIGE
WIRKUNG
DER
NTS
AUF
DNS-EBENE
142
4.V.5.
NEGATIV
REGULIERENDE
WIRKUNG
DER
NTS
AUF
DEN
SV40-PROMOTOR
143
4.
VI.
DIE
NTS-SEQUENZ
ZEIGT
EIN
VERAENDERTES
BINDUNGSMUSTER
IN
INFIZIERTEN
GLIAZELLEN
144
4.
VI.
1.
SPEZIFISCHE
BINDUNGSAKTIVITAETEN
IN
ALLEN
ZELLINIEN
144
4.VI.2.
HINWEISE
AUF
EINEN
ZUSAETZLICHEN
ODER
MODIFIZIERTEN
NTS
BINDENDEN
FAKTOR
IN
INFIZIERTEN
GLIAZELLEN
145
4.
VII.
MOEGLICHE
WIRKUNGSWEISE
DER
NTS-REGULATION
IN
INFIZIERTEN
GLIAZELLEN
UND
BEDEUTUNG
FUER
DIE
VIRALE
EXPRESSION
146
5.
ZUSAMMENFASSUNG
150
6.
ANHANG
152
6.1.
PLASMIDKARTEN
152
6.2.
OLIGONUKLEOTIDE
157
6.3.
TABELLARISCHE
ZUSAMMENFASSUNG
DER
TRANSFEKTIONSERGEBNISSE
UNTER
3.IH.
159
6.4.
TABELLARISCHE
ZUSAMMENFASSUNG
DER
TRANSFEKTIONSERGEBNISSE
UNTER
3.V.
169
6.4.1.
TABELLEN
ZU
3.
V.A.L
169
6.4.2.
TABELLEN
ZU
3.V.A.2.A.
177
6.4.3.
TABELLEN
ZU
3.V.A.2.B.
185
6.4.4.
TABELLEN
ZU
3.V.A.3.
192
6.4.5.
TABELLEN
ZU
3.V.A.4.
198
6.5.
TABELLEN
ZU
3.V.B.
205
7.
LITERATURVERZEICHNIS
209
8.
VEROEFFENTLICHUNGEN
223
9.
ABKIIRZUNGSVERZEICHNIS
225 |
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