Entwicklung eines immunoenzymometrischen Assays (IEMA) für die Bestimmung des Glykogenphosphorylase-Isoenzyms BB und mögliche Indikationen für dessen Einsatz in der serologischen Frühdiagnostik akut ischämischer Herzerkrankungen:
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1993
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| Ausgabe: | [Mikrofiche-Ausg.] |
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| Beschreibung: | Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 1994. - Mikrofiche-Ausg.: 3 Mikrofiches : 24x |
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INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKUERZUNGEN 5
1. EINLEITUNG 8
1.1. KORONARE HERZKRANKHEIT 8
1.1.1. STABILE ANGINA PECTORIS 9
1.1.2. INSTABILE ANGINA PECTORIS 10
1.1.3. AKUTER HERZINFARKT 11
1.2. DIAGNOSTIK DES AKUTEN HERZINFARKTS 13
1.3. KLINISCH-CHEMISCHE DIAGNOSTIK DES AKUTEN HERZINFARKTS 15
1.3.1. ASPARTAT-AMINOTRANSFERASE (ASAT) 16
1.3.2. LAKTATDEHYDROGENASE (LDH)
YY
- 17
1.3.3. KREATINKINASE (GESAMT-CK) 18
1.3.4. KREATINKINASE MB (CK-MB) 19
1.3.5. MYOGLOBIN (MB) 21
1.3.6. TROPONIN T (TN-T) 22
1.3.7. GLYKOGENPHOSPHORYLASE (GP) 23
1.3.7.1. BIOCHEMIE, FUNKTION UND FREISETZUNGSMECHANISMUS 23
1.3.7.2. GLYKOGENPHOSPHORYLASE ALS DIAGNOSTISCHER PARAMETER 27
1.4. ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 30
2. MATERIAL UND METHODEN 31
2.1. PRAEPARATION DES ISOENZYMS BB DER GLYKOGENPHOSPHORYLASE (GP-BB)
ALS ANTIGEN 31
2.1.1. PRAEPARATION DER GP-BB AUS MENSCHLICHEM MYOKARDGEWEBE 31
2.1.2. IMMUNINHIBITIONSTEST 31
2.2.
HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 32
2.2.1 POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN GLYKOGENPHOSPHORYLASE-ISOENZYM BB 32
2.2.2. POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN MAUS-IMMUNGLOBULINE;
POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN KANINCHEN-IMMUNGLOBULINE 32
2.2.3. AUFREINIGUNG DER IMMUNGLOBULINE AUS ANTISEREN 33
2.3. HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 33
2.3.1. IMMUNISIERUNG 33
2.3.2. HYBRIDOMTECHNIK 34
2.3.2.1. ZELLFUSION 34
2.3.2.2. ZELLKULTIVIERUNG 35
2.3.2.3. HYBRIDOMSELEKTION 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.3.2.4. KRYOKONSERVIERUNG DER HYBRIDOMZELLEN 35
2.3.3. MASSENPRODUKTION 36
2.3.4. AUFREINIGUNG 36
2.4. CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 37
2.4.1. PHOTOMETRIE 37
2.4.2. SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE 37
2.4.3. IMMUNCHEMISCHE NACHWEISMETHODEN 38
2.4.3.1. IMMUNO-DOT-ASSAY 38
2.4.3.2. ZWEI-SEITEN-BINDUNGSTEST 39
2.4.3.3. IMMUNO-BLOT-ANALYSE 40
2.4.4. IMMUNGLOBULIN-SUBKLASSEN-TYPISIERUNG 40
2.4.5. IMMUNGLOBULIN-L-KETTEN-BESTIMMUNG 40
2.4.6. KOMBINIERBARKEIT MONOKLONALER ANTIKOERPER IM ZWEI-SEITEN-
BINDUNGSTEST 41
2.4.6.1. FLUORESCEIN-ISOTHIOCYANAT-MARKIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 41
2.4.6.2. AUSTESTUNG DER KOMBINATIONS VARIANTEN 41
2.5. BINDUNG DER ANTIKOERPER AN DIE FESTPHASE DER MIKROTITERPLATTE 42
2.6. LAGERUNG ANTIKOERPER-BESCHICHTETER MIKROTITERPLATTEN 42
2.7. KONJUGATION DER ANTIKOERPER MIT MEERRETTICH-PEROXIDASE 43
2.7.1. PERJODAT-METHODE 43
2.7.2. KONJUGATION MIT HILFE VON N-SUCCINIMIDYL-3-(2-PYRIDYLDITHIO)-
PROPRIONAT (SPDP) 44
2.8. HERSTELLUNG VON GP-BB-FREIEM HUMANPLASMA 45
2.8.1. GEWINNUNG DES HUMANPLASMAS 45
2.8.2. SEPARATION VON GP-BB AUS HUMANPLASMA MITTELS IMMUNAFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE 45
2.9. PROBENMATERIAL UND PROBENAUFBEREITUNG FUER DIE BESTIMMUNG VON
GP-BB IM IEMA 46
2.10. BESTIMMUNG BIOCHEMISCHER PARAMETER 46
2.10.1. GESAMT-CK-UND CK-MB-AKTIVITAET 46
2.10.2. CK-MB-MASSE 47
2.10.3. MYOGLOBIN (MB) 47
3. ERGEBNISSE 48
3.1. POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN GP-BB 48
3.2. MONOKLONALE ANTIKOERPER GEGEN GP-BB 48
3.2.1. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER HYBRIDOMZELLINIEN ZUR
GEWINNUNG GP-BB-SPEZIFISCHER MONOKLONALER ANTIKOERPER 48
3.2.2. CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 50
3.2.2.1. TYPISIERUNG 50
3.2.2.2. KREUZREAKTIVITAET ZU ANDEREN ISOENZYMEN DER GP 50
3.2.2.3. AUFREINIGUNG 51
3.2.2.4. INHIBITION DER KATALYTISCHEN AKTIVITAET DER GP-BB 53
3.2.2.5. KOMBINIERBARKEIT IM ZWEI-SEITEN-BINDUNGSTEST UND DARAUS
ABGELEITETE
EPITOPVERTEILUNG 53
3.3. IMMUNOENZYMOMETRISCHER ASSAY (IEMA) ZUR QUANTITATIVEN
BESTIMMUNG DER GP-BB IM HUMANPLASMA 57
3.3.1. ENTWICKLUNG UND OPTIMIERUNG 57
3.3.1.1. BESCHICHTUNG DER MIKROTITERPLATTEN MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN
57
3.3.1.2. BLOCKIERUNG 60
3.3.1.3. KONJUGAT 61
3.3.1.4. INKUBATION 62
3.3.1.5. TRENNUNG DER FREIEN UND GEBUNDENEN IMMUNREAKTANTEN 65
3.3.1.6. SUBSTRATLOESUNG 66
3.3.2. TESTDURCHFUEHRUNG 66
3.3.3. LEISTUNGSMERKMALE DES IEMA 69
3.3.3.1. SENSITIVITAET 69
3.3.3.2. PRAEZISION 70
3.3.3.3. MESSBEREICH 70
3.3.3.4. WIEDERFINDUNG 71
3.3.3.5. LINEARITAET 72
3.3.3.6. ANALYTISCHE SPEZIFITAET 73
3.3.3.7. METHODENVERGLEICH 74
3.3.3.8. REFERENZBEREICH 75
3.4. LABORDIAGNOSTISCHE ANWENDUNG DES GP-BB-IEMA 76
4. DISKUSSION 91
4.1. MONOKLONALE ANTIKOERPER GEGEN GP-BB 91
4.2. IMMUNOENZYMOMETRISCHER ASSAY (IEMA) ZUR QUANTITATIVEN
BESTIMMUNG DER GP-BB IM HUMANPLASMA 94
4.3. LABORDIAGNOSTISCHE ANWENDUNG DES GP-BB-IEMA UND SICH
DARAUS ABLEITENDE EINSATZMOEGLICHKEITEN IN DER SEROLOGISCHEN
DIAGNOSTIK AKUT ISCHAEMISCHER HERZERKRANKUNGEN 101
5. ZUSATZ 109
6. ZUSAMMENFASSUNG 110
7. LITERATURVERZEICHNIS 114
ANHANG |
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