Untersuchungen zur Struktur-Funktionsbeziehung der Tyrocidinsynthetase-1:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
ABKUERZUNGEN
.
1
2.
EINLEITUNG
.
3
2.1
ANTIBIOTIKA
.
3
2.2
PEPTIDANTIBIOTIKA
AUS
BACILLUS
BREVIS
.
3
2.3
BIOSYNTHESE
VON
TYROCIDIN
.
5
2.4
STRUKTUR
DER
TYROCIDINSYNTHETASE
1
.
8
2.5
AUFGABENSTELLUNG
.
11
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
12
3.1
MIKROORGANISMEN
.
12
3.2
MEDIEN
.
12
3.3
MATERIALIEN
.
13
3.4
GERAETE
.
14
3.5
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
15
3.6
VEKTOREN
.
15
3.7
DNA-ISOLIERUNG
.
17
3.7.1
PLASMIDPRAEPARATION
MIT
QIAGEN-ANIONENTAUSCHERSAEULEN
.
17
3.7.2
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
PHAGEMID-DNA
.
18
3.8
DNA-HYDROLYSE
MITTELS
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
19
3.9
AUFIULLEN
UEBERHAENGENDER
DNA-ENDEN
.
20
3.10
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
20
3.11
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
21
3.12
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
EINEM
AGAROSEGEL
.
22
3.13
DNA-LIGATION
.
22
3.14
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ESCHERICHIA
COLI
ZELLEN
.
23
3.15
TRANSFORMATION
VON
ESCHERICHIA
COLI
ZELLEN
.
23
3.16
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BACILLUS
SUBTILIS
ZELLEN
.
24
3.17
TRANSFORMATION
VON
BACILLUS
SUBTILIS
ZELLEN
.
25
3.18
PHOSPHORILIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
25
3.19
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
.
26
3.20
DNA-SEQUENZIERUNG
.
29
3.21
ENZYMPRAEPARATION
.
31
3.21.1
ANZUCHT
DER
TYCA-PRODUZENTEN
.
31
3.21.2
PRAEPARATION
DER
ROHEXTRAKTE
.
32
3.21.3
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
33
INHALTSVERZEICHNIS
N
3.21.4
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
MIT
FPLC
.
33
3.21.4.1
GELFILTRATION
AN
SUPERDEX
200
.
33
3.21.4.2
HIC
AN
PHENYLSEPHAROSE
.
34
3.21.4.3
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
AN
MONO
Q
.
34
3.22
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
35
3.23
WESTEMBLOT
.
37
3.24
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
38
3.25
ENZYMTESTS
.
39
3.25.1
ATP-PPJ
AUSTAUSCHREAKTION
.
39
3.25.2
PROTEINBELADUNG
MIT
[
14
C]PHENYLALANIN
.
40
3.25.3
THIOESTERSPALTUNG
.
41
3.26
IN
VIVO
SS-ALANIN
EINBAU
.
41
3.26.1
SS-ALANIN
EINBAU
IN
E.
COLI
SJ16
.
42
3.26.2
SS-ALANIN
EINBAU
IN
E.
COLI
JM105
.
43
3.26.3
SS-ALANIN
EINBAU
IN
B.
BREVIS
.
43
3.26.4
FLUOROGRAPHIE
.
44
4.
ERGEBNISSE
.
45
4.1
KLONIERUNG
DES
TYCA-GENS
IN
DEN
EINZELSTRANGVEKTOR
PTZ19U
.
45
4.2
KORREKTUR
DER
TYCA-GENSEQUENZ
.
47
4.3
REINIGUNG
VON
TYCA
AUS
DEM
UEBERPRODUZENTEN
E.
COLI
JM
105/PTZ19URYC/L
.
48
4.3.1
GELFILTRATION
AN
SUPERDEX
200
HR
16/60
.
48
4.3.2
HIC
AN
PHENYLSEPHAROSE
HR
16/10
.
49
4.3.3
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
AN
MONO
Q
HR
5/5
.
51
4.4
KLONIERUNG
DES
TYC
A-GENS
IN
EINEN
B.
SUBTILIS
SHUTTLEVEKTOR
.
53
4.5
EXPRESSION
VON
TYCA
IN
B.
SUBTILIS
.
56
4.6
HERSTELLUNG
DER
TYCA-MUTANTEN
.
59
4.7
ANALYSE
DES
ATP-PPJ
AUSTAUSCHVERHALTENS
VON
TYCA-MUTANTEN
.
63
4.8
BESTIMMUNG
DER
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
VON
ATP
UND
PHENYLALANIN
.
64
4.9
BELADUNG
VON
TYCA-MUTANTEN
MIT
[
14
C]PHENYLALANIN
.
68
4.10
SPALTUNG
DES
TYCA-[
14
C]PHENYLALANIN-KOMPLEXES
.
69
4.11
KONFORMATIONSANALYSE
DER
SPALTPRODUKTE
.
72
4.12
IN
VZ'W-MARKIERUNG
VON
TYCA
.
72
4.12.1
SS-[
3
H]ALANIN
EINBAU
IN
E.
COLI
SJ16/PTZ19UTYC4
.
73
4.12.2
SS-PH]ALANIN
EINBAU
IN
B.
AEREV/S
ATCC
8185
.
74
4.12.3
SS-PH]ALANIN
EINBAU
IN
E.
COLI
JM105/PTZ19UTYCA
.
76
INHALTSVERZEICHNIS
III
5.
DISKUSSION
.
78
5.1
EXPRESSION
VON
TYCA
.
78
5.2
REAKTIVE
ZENTREN
VON
TYCA
.
79
5.2.1
ATP-BINDUNG
.
79
5.2.2
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
.
81
5.2.3
THIOESTERBILDUNG
.
82
5.2.4
TYCA-MARKIERUNG
MIT
B-ALANIN
.
83
5.3
SEQUENZKORREKTUREN
.
85
5.4
RACEMISIERUNG
VON
PHENYLALANIN
.
88
5.5
AUSBLICK
.
89
6.
ANHANG
KORRIGIERTE
TYCA
-SEQUENZ
.
90
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
95 |
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