Klassifizierung und Identifizierung von Milchsäurebakterien mit Hilfe molekularbiologischer Methoden:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 163 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
EINLEITUNG
1
B.
MATERIAL
UND
METHODEN
7
B.1
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
12
B.2
NAEHRMEDIEN
UND
ZUSATZSTOFFE
12
2.1.
NAEHRMEDIEN
12
2.2
ZUSATZSTOFFE
14
B.3
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
14
3.1
ANZUCHT
14
3.2
STANUNHALTUNG
14
B.4
DNS
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
HOCHMOLEKULARER
DNS
14
4.1
DNS
ISOLIERUNG
NACH
MARMUR
14
4.2
DNS
ISOLIERUNG
NACH
LAUER
ET
AL.,
1987
16
4.3
DNS
ISOLIERUNG
MIT
DEM
A.S.
A.P.
GENOMIC
DNA
ISOLATION
KIT
18
4.4
DNS
ISOLIERUNG
NACH
LEWINGTON
ET
AL.,
1987
18
4.5
SCHNELLISOLIERUNG
VON
DNS/RNS-ROHEXTRAKTEN
19
4.6
SCHNELLISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
LEBENSMITTELN
20
B.5
PLASMIDISOLIERUNG
21
5.1
PLASMIDISOLIERUNG
NACH
HOLMES
UND
QUIGLEY
21
5.2
PLASMIDISOLIERUNG
DURCH
ALKALISCHE
LYSE
21
B.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
22
6.1
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
22
6.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DURCH
ETHIDIUMBROMID-TUEPFELPLATTE
22
B.7
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
23
B.8
ISOLIERUNG,
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
VON
DNS-FRAGMENTEN
23
B.9
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
NUKLEINSAEUREN
24
9.1
SPALTUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
24
9.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-MOLEKUELEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
24
9.3
VERKNUEPFUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNS-LIGASE
24
9.4
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'-OH-ENDEN
MIT
T4-POLYNUKLEOTID-KINASE
25
9.5
VERLAENGERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
TERMINALER
NUKLEOTIDYL-TRANSFERASE
25
B.10
TRANSFONNATION
VON
E.COLI
26
10.1
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
26
10.2
ELEKTROPORATION
27
B.LL
SYNTHESE,
REINIGUNG
UND
KONTROLLE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
28
11.1
ABLOESEN
DER
OLIGONUKLEOTIDE
VON
DER
FESTPHASE
28
11.2
REINIGUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
28
11.3
QUALITAETS-UND
REINHEITSKONTROLLE
MITTELS
POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE(PAGE)
29
11.4
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
29
11.5
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
30
B.12
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
MITTELS
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
NACH
SAIKI
ET
AL.
1988
32
12.1
PRINZIP
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
32
12.2
DURCHFUEHRUNG
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
32
12.3
HYBRIDISIERUNGSTEMPERATUREN
34
12.4
AMPLIFIKATION
VON
DNS
AUS
INTAKTEN
ZELLEN
34
12.5
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
NICHT
SPEZIFISCHEN
PRIMERN
(ARBITRARLY-PRIMED-PCR)
34
B.13
SEQUENZANALYSE
VON
DNS-MOLEKUELEN
35
13.1
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
35
13.1.1
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNS
36
13
1.2
DIREKTE
SEQUENZIERUNG
IN
VITRO
AMPLIFIZIERTER
DNS-FRAGMENTE
36
13.1.3
VERBESSERUNG
DER
SEQUENZIERERGEBNISSE
MIT
TERMINALER
TRANSFERASE
37
13.1.4
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UND
AUTORADIOGRAPHIE
37
13.2
NICHT
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
38
13.2.1
VERWENDETE
MARKIERUNG
38
13.2.2
DURCHFUEHRUNG
DER
SEQUENZIERUNG
38
13.2.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UND
TRANSFER
VON
DNS
FRAGMENTEN
AUF
MEMBRANEN
38
13.2.4
DETEKTION
DER
DNS-FRAGMENTE
39
B.14
AUSWERTUNG DER
SEQUENZDATEN
40
14.1
VERGLEICHENDE
ANORDNUNG
VON
SEQUENZEN
(ALIGNMENT)
40
14.2
REKONSTRUKTION
VON
STAMMBAEUMEN
41
14.3
VERWENDETE
COMPUTERPROGRAMME
41
B.1S
HYBRIDISIERUNG
42
15.1
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
MEMBRANEN
42
15.1.1
VERWENDETE
MEMBRANEN
42
15.1.2
DOTBLOT
42
15.1.3
SOUTHEMBLOT
43
15.1.3.1
KAPILLARBLOT
43
15.1.3.2
VACUUMBLOT
43
15.1.4
FIXIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
44
15.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
44
15.2.1
MARKIERUNGSMETHODEN
44
15.2.1.1
NICKTRANSLATION
(RIGBY
ET
AL.,
1974)
44
15.2.1.2
5
'-ENDMARKIERUNG
MIT
POLYNUKLEOTIDKINASE
45
15.2.1.3
3
'-ENDMARKIERUNG
MIT
TERMINALER
TRANSFERASE
45
15.2.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
46
15.2.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
POLYNUKLEOTIDEN
47
15.3
HYBRIDISIERUNG
MIT
NICHT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
48
15.3.1
DIGOXIGENIN-MARKIERUNG
48
15.3.1.1
3
'-ENDMARKIERUNG
MIT
TERMINALER
TRANSFERASE
48
15.3.1.2
5
'-ENDMARKIERUNG
DURCH
CHEMISCHE
VERKNUEPFUNG
48
15.3.1.3
EINBAU
VON
DIGOXIGENIN
IN
DNS-FRAGMENTE
DURCH
POLYMERASE-KETTENREAKTION
49
15.3.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
50
15.3.3
DETEKTION
DER
HYBRIDE
50
15.4
REVERSE-DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
51
15.5
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
VON
AUTORADIOGRAMMEN
51
C.
ERGEBNISSE
52
C.L
SEQUENZANALYSE
VON
16S-RRNS-GENEN
52
1.1
SEQUENZIERUNG
VON
KLONIERTEN
16S
RRNS-GENEN
52
1.1.1
ORGANISMEN
52
1.1.2
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
RDNS
52
1.1.3
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
1
6S-AMPLIFIKATE
52
1.2
DIREKTE
SEQUENZIERUNG
VON
IN
VITRO
AMPLIFIZIERTEN
16S-RDNS
FRAGMENTEN
53
1.2.1
ORGANISMEN
UND
SEQUENZIERTE
BEREICHE
53
1.2.2
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
RDNS
54
1.3
1.4
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
16S-RDNS-FRAGMENTEN
SEQUENZDATENANALYSE
54
55
C.2
SEQUENZANALYSE
VON
23S-RRNS-GENEN
55
2.1
ORGANISMEN
UND
SEQUENZIERTE
BEREICHE
55
2.2
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
23
S-RDNS-FRAGMENTEN
55
2.3
SEQUENZDATENANALYSE
57
C.3
DNS-DNS
HYBRIDISIERUNG
ZUR
UNTERSUCHUNG
DES
VERWANDTSCHAFTSGRADES
VON
STREPTOCOCCUS
THERMOPKILUS
UND
STREPTOCOCCUS
SALIVARIUS
57
C.4
KONSTRUKTION
SPEZIFISCHER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
59
4.1
GEGEN
16S
RRNS
GERICHTETE
SONDEN59
4.1.1
SPEZIFITAET,
SEQUENZEN
UND
BINDUNGSPOSITIONEN
61
4.1.2
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
61
4.2
GEGEN
23
S-RRNS
GERICHTETE
SONDEN
62
4.2.1
SPEZIFITAET,
SEQUENZEN
UND
BINDUNGSPOSITIONEN
63
4.2.2
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
64
4.3
ERGEBNISSE
DER
HYBRIDISIERUNGEN
64
4.3.1
DIE
SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
LSANFRANCISCO,
LFRUCTIVORANS,
LFERMENTUM
UND
LPONTIS
64
4.3.2
DIE
SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
LBREVIS,
LBUCHNERI,
LPARABUCHNERI,
L.KEFIR
UND
L.HILGARDII
66
4.3.3
DIE
SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
L.LINDNERI,
L.PLANTARUM
UND
L.COLLINOIDES
67
4.3.4
DIE
SONDE
MIT
SPEZIFITAET
FUER
''LBREVIS"
L222
68
4.3.5
DIE
SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
S.THERMOPHILUS
UND
S.SALIVARIUS
69
4.3.6
DIE
SONDEN
MIT
SPEZIFITAET
FUER
"LPEROLENS",
LAMYLOVORUS,
L.CRISPATUS
UND
L.
KEFIRANOFACIENS
71
C.5
REVERSE
DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
73
5.1
IMMOBILISIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
73
5.1.1
VERLAENGERUNG
MIT
TERMINALER
TRANSFERASE
73
5.1.2
FIXIERUNG
DURCH
UV-BESTRAHLUNG
73
5.2
DNS-ISOLIERUNG
AUS
LEBENSMITTELN
75
5.3
IN
VITRO
AMPLIFIKATION
VON
RRNS-GENFRAGMENTEN
76
5.3.1
AUSWAHL
DER
AMPLIFIKATIONSPRIMER
77
5.3.2
MARKIERUNG
DER
RRNS-GENFRAGMENTE
77
5.4
REVERSE
DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
REINKULTUREN
78
5.5
REVERSE
DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
LEBENSMITTELN
78
5.6
UEBERPRUEFUNG
DER
SENSITIVITAET
DER
REVERSE
DOT
BLOT
HYBRIDISIERUNG
81
5.6.1
SENSITIVITAET
DER
REVERSEN-DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
BEI
EINER
REINKULTUR
81
5.6.2
SENSITIVITAET
DER
REVERSEN-DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
BEI
JOGHURT
81
C.6
POLYMERASE-KETTENREAKTION
MIT
NICHT
SPEZIFISCHEN
PRIMERN
(ARBITRARILY
PRIMED
PCR)
85
6.1
DNS-ISOLIERUNG
85
6.2
AUSWAHL
DER
AMPLIFIKATIONSPRIMER
85
6.3
EINFLUSS
DER
DNS-MENGE
86
6.4
VERGLEICH
DER
AP-PCR-MUSTER
VERSCHIEDENER
LAKTOBAZILLENARTEN
UND
-STAEMME
87
6.4.1
VERGLEICH
DER
MUSTER
VON
L.BREVIS
UND
LMLGARDII
87
6.4.2
VERGLEICH
DER
MUSTER
VON
L-BREVIS
UND
ISOLATEN
AUS
BIER
88
6.4.3
VERGLEICH
DER
MUSTER
VON
L.KEFIR,
L.BUCHNERI
UND
LPARABUCHNERI
89
6.4.4
VERGLEICH
DER
MUSTER
VON
LREUTERI
UND
LFERMENTUM
90
D.
DISKUSSION
91
D.L.
SEQUENZIERUNG
VON
RRNS-GENEN
91
1.1
AMPLIFIKATION
VON
RDNS-FRAGMENTEN
91
1.2
SEQUENZIERUNG
KLONIERTER
AMPLIFIKATE
91
1.3
DIREKTE
SEQUENZIERUNG
VON
AMPLIFIKATEN
92
1.4
NICHT
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
92
D.2.
PHYLOGENIE DER
LAKTOBAZILLEN
93
2.1
PHYLOGENIE
BEREITS
BESCHRIEBENER
ARTEN
93
2.2
PHYLOGENIE
VON
VERSCHIEDENEN
ISOLATEN
AUS
LEBENSMITTELN
96
D3.
PHYLOGENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
STREPTOCOCCUS
THERMOPHILUS
100
3.1
PHYLOGENIE
VON
STREPTOCOCCUS
THERMOPHILUS
100
3.2
DNS-DNS
HYBRIDISIERUNG
VON
S.THERMOPHILUS
UND
S.SALIVARIUS
103
D.4.
KONSTRUKTION
VON
NUKLEINSAEURESONDEN
104
4.1
DATENGEWINNUNG
ZUR
KONSTRUKTION
VON
NUKLEINSAEURESONDEN
104
4.2
SONDENDESIGN
107
4.3
BINDUNGSPOSITIONEN
UND
SPEZIFITAETEN
DER
SONDEN
107
4.3.1
SONDEN
FUER
LAKTOBAZILLEN
DER
"Z.CAREZ'"-GRUPPE
110
4.3.2
SONDEN
FUER
LAKTOBAZILLEN
DER
"L.DELBRUECKII"-GRUPPE
115
4.3.3
SONDEN
ZUR
DIFFERENZIERUNG
VON
STHERMOPHILUS
UND
S.SALIVARIUS
116
D.5.
ANWENDUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
IN
DER
REVERSEN
DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
116
5.1
NACHWEIS
VON
ORGANISMEN
IN
FERMENTIERTEN
LEBENSMITTELN
118
5.1.1
DNS-ISOLIERUNG
118
5.1.2
AMPLIFIKATION
UND
MARKIERUNG
VON
ZIELSEQUENZEN
118
5.1.3
UNTERSUCHUNG
VERSCHIEDENER
LEBENSMITTEL
119
5.2
SENSITIVITAET
DER
REVERSE-DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
120
5.3
BEURTEILUNG
DER
REVERSE-DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG
121
D.6.
DIFFERENZIERUNG
VON
LAKTOBAZILLEN
DURCH
PCR
MIT
NICHT
SPEZIFISCHEN
PRIMERN
(ARBITRARIIY-PRIMED-PCR)
122
6.1
DIE
WAHL
DES
PRIMERS
123
6.2
EINFLUSS
VON
QUALITAET
UND
KONZENTRATION
DER
DNS
123
6.3
UNTERSCHEIDUNG
VON
ARTEN
124
6.4
UNTERSCHEIDUNG
VON
STAEMMEN
128
6.5
BEURTEILUNG
DER
AP-PCR
128
E.
ZUSAMMENFASSUNG
129
F.
ANHANG
131
G.
LITERATURVERZEICHNIS
153 |
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