Ubiquitinierte Proteine in Chloroplasten und Wurzelspitzen von Vicia faba L. und deren Modulation:
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INHALT
1 EINLEITUNG. 1
1.1 DIE CHLOROPLASTEN . 1
1.1.2 STRUKTURELLE MERKMALE DER CHLOROPLASTEN. 1
1.1.3 DAS PLASTIDENGENOM. 3
1.2 DIE PROTEOLYSE ALS REGULATIONSMECHANISMUS IM PROTEINSTOFFWECHSEL. 4
1.3 CHARAKTERISIERUNG VON UBIQUITIN . 5
1.3.1 DAS UBIQUITIN-KONJUGIERENDE SYSTEM. 5
1.3.2 MOLEKULARE GENETIK DES UBIQUITIN-SYSTEMS . 8
1 3.3 POSTULIERTE FUNKTIONEN UND VORKOMMEN VON UBIQUITIN . 9
1.3.4 VORKOMMEN VON UBIQUITIN IN PFLANZLICHEN ZELLEN. 11
1.4 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT . 12
2 MATERIAL UND METHODEN . 13
2.1 ABKUERZUNGEN . 13
2.2 PFLANZENMATERIAL . 14
2.3 DIE CHLOROPLASTENISOL ATION . 14
2.4 HITZE- UND KLINOSTATENBEHANDLUNG VON
VICIA FABA PFLANZEN . 16
2.4.1 HITZEBEHANDLUNG . 16
2.4.2 KLINOSTATENBEHANDLUNG. 16
2.4.3 ISOLIERUNG VON CHLOROPLASTEN NACH HITZE- UND
KLINOSTATENROTATIONSVERSUCHEN . 16
2.4.4 NACHWEIS VON MITOCHONDRIALEN, CYTOSOLISCHEN UND VAKUOLAEREN
VERUNREINIGUNGEN VON
CHLOROPLASTEN . 17
2.5 INTAKTHEIT DER CHLOROPLASTEN . 17
2.6 DIE ISOLATION VON THYLAKOIDMEMBRANEN. 18
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.6.1 DIE INTAKTHEIT VON THYLAKOIDMEMBRANEN . 18
2.6.2 DIE SOLUBILISIERUNG VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN . 19
2.7 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN . 21
2.8 DIE PRAEPARATION VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN AUS ETIOPLASTEN. 21
2.9 INKUBATION ISOLIERTER CHLOROPLASTEN MIT UBIQUITIN . 22
2.10 DIE EXTRAKTION VON PROTEINEN AUS WURZELSPITZEN . 24
2.11 PROTEIN-UND CHLOROPHYLLBESTIMMUNG. 25
2.12 DIE GELELEKTROPHORESE . 25
2.13 DIE 2-DIMENSIONALE ELEKTROPHORESE (2D-ELEKTROPHORESE). 26
2.13.1 VORBEREITUNG UND DURCHFUEHRUNG DER 1. DIMENSION . 27
2.13.2 DURCHFUEHRUNG DER 2. DIMENSION . 28
2.14 WESTEM-IMMUNOBLOTTING . 29
2.15 HERSTELLUNG VON POLYKLONALEN UBIQUITIN-ANTIKOERPEM. 30
3 ERGEBNISSE . 31
3.1 ISOLATIONSMETHODEN VON CHLOROPLASTEN . 31
3.2 VERAENDERUNGEN VON THYLAKOIDPROTEINEN IN ABHAENGIGKEIT DER
CHLOROPLASTEN-
ENTWICKLUNG . 32
3.3 DIE ALTERSABHAENGJGE UNTERSUCHUNG VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN. 33
3.3.1 DIE GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON SDS-SOLUBILISIERTEN
THYLAKOIDMEMBRAN
PROTEINEN . 33
3.3.2 WESTEM-IMMUNOBLOT VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN MIT POLYKLONALEN
UBIQUITIN-
ANTIKOERPEM . 34
3.3.3 IDENTIFIZIERUNG UBIQUITINIERTER PROTEINE. 35
3.3.4 DIE 2-DIMENSIONALE ELEKTROPHORESE VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN .
36
3.3.5 IMMUNOBLOT-ANALYSEN VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN NACH DER
2D-ELEKTROPHORESE
MIT POLYKLONALEN UBIQUITIN-ANTIKOERPEM.38
II
3.4 VERAENDERUNG VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN WAEHREND DER
CHLOROPLASTENDIFFERENZIE-
RUNG. 40
3.5 VERAENDERUNGEN UBIQUITINIERTER THYLAKOIDPROTEINE NACH ENZYMATISCHEN
BEHANDLUNGEN.41
3.5.1 ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN MIT DER
ENDOPROTEINASE
LYS-C . 41
3.5.2 INKUBATION VON THYLAKOIDMEMBRANPROTEINEN MIT EINER AUS
HEFEEXTRAKTEN GEWONNENEN
UBIQUITIN-HYDROLASEFRAKTION . 44
3.6 IMPORT VON UBIQUITIN IN CHLOROPLASTEN. 45
3 7 VERAENDERUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN PROTEINEN IN CHLOROPLASTEN NACH
HITZESTRESS . 56
3.8 VERAENDERUNGEN VON PROTEINEN DER THYLAKOIDE UND DER STROMAFRAKTION
NACH KLINO-
STATENROTATION . 57
3.9 VERAENDERUNGEN VON PROTEINEN IN WURZELSPITZEN NACH
KLINOSTATENROTATIONSVER-
SUCHEN . 60
3.9.1 WESTEM-IMMUNOBLOT VON PROTEINEN AUS WURZEL EXTRAKTEN MIT
UBIQUITIN-
ANTIKOERPEM . 60
3.9.2 VERAENDERUNGEN EINES 80 AMINOSAEUREN UMFASSENDEN EXTENSIONSPROTEINS
NACH KLINO-
STATENROTATIONEN. 63
3.9.3 VERAENDERUNG VON CALMODULIN-AEHNLICHEN PROTEINEN IN WURZELSPITZEN
NACH KLINO-
STATENROTATIONEN. 64
3.9.4 VERAENDERUNG VON AKTIN NACH KLINOSTATENROTATIONEN. 66
4 DISKUSSION . 68
4.1 BEWERTUNG DER ISOLATIONSMETHODEN VON CHLOROPLASTEN . 68
4.1.1 BEWERTUNG DER 0
;-PRODUKTION ISOLIERTER THYLAKOIDMEMBRANEN. 68
4.1.2 BEWERTUNG DER CHLOROPHYLL-UND PROTEINWERTE ISOLIERTER
THYLAKOIDMEMBRANEN. 69
4.2 NIEDERMOLEKULARE UBIQUITIN-KONJUGATE IN THYLAKOIDMEMBRANEN . 70
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG NIEDERMOLEKULARER THYLAKOIDPROTEINE ALS
UBIQUITIN-KONJUGATE
. 70
4.2.2 CHARAKTERISIERUNG NIEDERMOLEKULARER UBIQUITIN-KONJUGATE . 72
III
4.2.3 BEDEUTUNG DER UBIQUITINIERUNG NIEDERMOLEKULARER THYLAKOIDPROTEINE
. 74
4.3 HOEHERMOLEKULARE UBIQUITIN-KONJUGATE (CA. 30 KDA) IN
THYLAKOIDMEMBRANEN. 75
4.3.1 IDENTIFIZIERUNG HOEHERMOLEKULARER UBIQUITIN-KONJUGATE IN
THYLAKOIDEN. 75
4.3.2 BEDEUTUNG DER UBIQUITINIERUNG HOEHERMOLEKULARER THYLAKOIDPROTEINE.
76
4.4 ENZYMATISCHER NACHWEIS VON UBIQUITIN-KONJUGATEN IN
THYLAKOIDMEMBRANEN . 77
4.5 IMPORT VON FREIEM UBIQUITIN IN DIE CHLOROPIASTEN. 79
4.5.1 EINFLUSS VON UBIQUITIN AUF DAS PROTEINMUSTER VON CHLOROPLASTEN 9
TAGE ALTER PFLAN
ZEN . 79
4.5.2 EINFLUSS VON UBIQUITIN AUF DAS PROTEINMUSTER VON CHLOROPLASTEN 3
WOCHEN ALTER
PFLANZEN. 81
4.5.3 EINFLUSS VON LEUPEPTIN AUF DEN NACHWEIS VON UBIQUITIN IN
CHLOROPLASTEN . 82
4.6 EINFLUSS VON HITZESTRESS AUF THYLAKOIDMEMBRANPROTEINE . 83
4.7 EINFLUSS DER OMNILATERALEN GRAVISTIMULATION AUF THYLAKOIDMEMBRAN- UND
STROMA
PROTEINE . 85
4.8 EINFLUSS DER OMNILATERALEN GRAVISTIMULATION AUF DAS PROTEINMUSTER VON
WURZELSPITZEN
EXTRAKTEN . 87
4.8.1 EINFLUSS DER KLINOSTATENROTATION AUF DAS UBIQUITIN-KONJUGAT-MUSTER
IN WURZEL-
SPITZEN . 88
4.8.2 VERAENDERUNGEN EINES BASISCHEN EXTENSIONSPROTEINS NACH
KLINOSTATENROTATIONEN. 88
4.8.3 EINFLUSS DER GRAVISTIMULATION AUF DAS MUSTER VON
CALMODULIN-PROTEINEN . 89
4.8.4 EINFLUSS DER KLINOSTATENROTATION AUF DAS AKTIN-PROTEIN-MUSTER. 91
5 ZUSAMMENFASSUNG. 92
6 LITERATURVERZEICHNIS. 94
7 ANHANG . 111
IV |
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