Untersuchungen zur Funktion der Prosequenz im Vorläufermolekül bei der Biosynthese neurotropher Faktoren und Charakterisierung eines Neurotrophinheterodimers:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 1994 |
| Beschreibung: | 110 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
2.
3.
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.6.1
3.6.1.1
3.6.1.2
EINLEITUNG
1
DIE
NGF-FAMILIE
NEUROTROPHER
FAKTOREN
(NEUROTROPHINE)
UND
IHRE
FUNKTIONEN
1
APOPTOSIS
UND
NEKROSIS:
VERSCHIEDENE
FORMEN
DES
ZELLTODES
3
STRUKTUR
DER
NEUROTROPHINE
4
NEUROTROPHIN-REZEPTOREN
UND
SIGNALTRANSDUKTION
6
BIOSYNTHESE
VON
NEUROTROPHINEN
8
DAS
VACCINIA-VIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
12
ZIEL
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
14
ABKUERZUNGEN
16
MATERIAL
UND
METHODEN
18
CHEMIKALIEN
18
BESONDERE
GERAETE
UND
CHROMATOGRAPHIEZUBEHOER
19
BAKTERIEN,
VEKTOREN
UND
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
19
TIERE
UND
ZELLINIEN
20
LOESUNGEN
20
METHODEN
26
GENTECHNOLOGISCHE
METHODEN
27
VERDAU
VON
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
27
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION
27
3.6.1.3 FAELLUNG
VON
DNS
27
3.6.1.4
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMNIUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
3.6.1.5
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNS
28
3.6.1.6
PRAEPARATION
VON
BAKTERIEN-PLASMIDEN
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
28
3.6.1.7
PRAEPARATION
VON
BAKTERIEN-PLASMIDEN
FUER
PRAEPARATIVE
ZWECKE
29
3.6.1.8
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
30
3.6.1.9
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
30
3.6.1.10
AUFIUELLREAKTION
VON
5
'-UEBERSTEHENDEN
RESTRIKTIONSVERDAU-ENDEN
31
3.6.1.11
ABVERDAUEN
VON
3
'-UEBERSTEHENDEN
RESTRIKTIONSVERDAU-ENDEN
31
3.6.1.12
LIGATION
VON
VEKTOR
UND
PASSAGIERFRAGMENT
31
3.6.1.13
ELEKTROTRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
32
3.6.1.14
AMPLIFIKATION
VON
DNS
DURCH
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
32
3.6.1.15
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
M13-PLASMIDEN
33
3.6.1.16
INFEKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
M13-PHAGEN
33
3.6.1.17
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRAENGIGER
ML3-PLASMID-DNS
34
3.6.1.18
GERICHTETE
SEQUENZMUTAGENESE
VON
DNS
34
3.6
1.19
OLIGODESOXYNUKLEOTID-SYNTHESE
35
3
6.1.20
SEQUENZIERUNG
VON
DNS
35
3.6.2
PROTEINCHEMISCHEN
METHODEN
36
3.6.2.1
DISKONTINUIERLICHE
SDS-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
36
3.6.2.2
PROTEIN-TRANSFER
(WESTERN-TRANSFER)
AUFPVDF-MEMBRAN
37
3.6.2.3
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
ACRYLAMIDGELEN
UND
IN
LOESUNG
38
3.6.24
PROTEINSEQUENZIERUNG
38
3.6.2.5
NACHWEIS
VON
ZUCKERRESTEN
AN
PROTEINEN
38
3.6.2.6
N-GLYKOSIDASE-F-VERDAU
39
3.6.2.7
AUFREINIGUNG
VON
NEUROTROPHINEN
AUS
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
MITTELS
RP
HPLC
39
3.6.2.8
TRENNUNG
VON
NEUROTROPHIN-DIMEREN
MITTELS
KATIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
40
3.6.2.9
GELFILTRATION
40
3.6.3
GEWEBEKULTUR,
VACCINIA-VIREN
UND
ZELLPRAEPARATION
41
3.6.3.1
SEKUNDAERKULTUREN
41
3.6.3.2
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
VACCINIA-VIREN
41
3
6.3.3
KONDITIONIERUNG
VON
MEDIUM
43
3.6.3.4
BIOLOGISCHE
TESTS
MIT
EMBRYONALEN
HUEHNCHEN-NEURONEN
43
3.6.3.5
PLATTENBESCHICHTUNG
FUER
DEN
BIOLOGISCHEN
TEST
44
4.
ERGEBNISSE
46
4.1
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
PROZESSIERUNGSMUTANTE
DES
BDNF-VORLAEUFERMOLEKUELS
46
4.1.1
GEZIELTE
MUTAGENESE
DER
BDNF-PROZESSIERUNGSSTELLE
46
4.1.2
HERSTELLUNG
EINES
REKOMBINANTEN
VACCINIA-VIRUS
MIT
DER
SJ23
-MUTANTE
47
4.1.3
INFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
SJ23-VACCINIA-VIREN
48
4.1.4
REINIGUNG
VON
BDNF
NACH
INFEKTION
MIT
SJ23-BDNF-VACCINIA-VIREN
50
4.1.5
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
VON
BDNF
PRODUZIERT
MIT
SJ23-BDNF-VACCINIA-VIREN
52
4.1.6
GLYKOSILIERUNG
DES
PARTIELLEN
BDNF-VORLAEUFERMOLEKUELS
52
4.1.7
N-GLYKOSIDASE-F-VERDAU
DES
PARTIELLEN
BDNF-VORLAEUFERMOLEKUELS
53
4.1.8
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DES
PARTIELLEN
BDNF-VORLAEUFERMOLEKUELS
55
4.2
ROLLE
DER
PROSEQUENZ-SPEZIFITAET
FUER
DIE
NEUROTROPHIN
*
EXPRESSION
UND
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
VON
MUTANTEN
PRODUZIERT
MIT
HETEROLOGEN
PRAEPROSEQUENZEN
57
4.2.1
WECHSELSEITIGER
AUSTAUSCH
DER
PRAEPROSEQUENZEN
ZWISCHEN
BDNF
UND
NT-3
57
4.2.2
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
VACCINIA-VIREN
MIT
DEN
PRAEPROSEQUENZAUSTAUSCH-MUTANTEN
NPBM
UND
BPNM
59
4.2
3
INFEKTION
VON
ZELLEN
MIT
NPBM
UND
BPNM-VACCINIA-VIREN
60
4.2.4
REINIGUNG
VON
NT-3
UND
BDNF
PRODUZIERT
MIT
BPNM
BZW.
NPBM-VACCINIA-VIREN
62
4.2.5
VERGLEICH
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAETEN
VON
NEUROTROPHINEN
PRODUZIERT
MIT
HOMO
ODER
HETEROLOGER
PROSEQUENZ
62
4.3 REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
HETERODIMEREN
ZWISCHEN
BDNF
UND
NT-3
64
4.3.1
CHROMATOGRAPHISCHE
TRENNUNG
VON
BDNF
UND
NT-3
NACH
EINZELINFEKTIONEN
64
4.3.2
BILDUNG
VON
HETERODIMEREN
NACH
KOINFEKTION
MIT
WT-NT-3
UND
NPBM-VACCINIA-VIREN
67
4.3.3
BILDUNG
VON
HETERODIMEREN
NACH
KOINFEKTION
MIT
WT-BDNF
UND
WT-NT-3-VACCINIA
VIREN
69
4.3.4
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DER
BDNF/NT-3-HETERODIMERE
71
5.
DISKUSSION
77
6.
LITERATUR
92
7.
LEBENSLAUF
109
8.
ZUSAMMENFASSUNG
~~
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