Lokalisierung und Charakterisierung der Ubichinon-Bindungsstelle des Komplex I (NADH:Ubichinon Oxidoreduktase) der Atmungskette:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1
1.
DIE
NADHTUBICHINON
OXIDOREDUKTASE
-
KOMPLEX
I
DER
ATMUNGSKETTE
1
2.
EINE
VERGLEICHENDE
STRUKTUR/FUNKTIONS-BETRACHTUNG
DER
POLYPEPTID
ZUSAMMENSETZUNG
DES
ENZYMKOMPLEXES
IN
VERSCHIEDENEN
ORGANISMEN
4
3.
DER
ELEKTRONENUEBERTRAEGER
UBICHINON
UND
DIE
INHIBITOREN
DES
KOMPLEX
I
8
4.
DIE
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
ALS
METHODISCHER
ANSATZ
ZUR
STRUKTUR/FUNKTIONS-AUFKLAERUNG
12
II.
ZIELE
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
13
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
14
1.
CHEMIKALIEN,
GERAETE
UND
STANDARDLOESUNGEN
14
1.1
CHEMIKALIEN
14
1.2
GERAETE
15
1.3
ZUSAMMENSETZUNG
VERWENDETER
PUFFER
UND
STAMMLOESUNGEN
15
2.
CHEMISCHE
SYNTHESEN
17
2.1
VORSTUFENSYNTHESEN
17
2.2
SYNTHESE
DER
UBICHINON-DERIVATE
20
2.2.1
SYNTHESE
DES
UBICHINON-DERIVATS
QQCJARNO2CG
20
2.2.2
SYNTHESE
DES
PHOTOCHEMISCH
REAKTIVEN
UBICHINON
DERIVATS
Q()C7ARN3
21
2.3
SYNTHESE
DER
CAPSAICIN-DERIVATE
23
2.3.1
SYNTHESE
DES
PHOTOCHEMISCH
REAKTIVEN
CAPSAICIN
DERIVATS
VACJARNJ
23
2.3.2
SYNTHESE
DES
CAPSAICIN-DERIVATS
VAC^
25
3.
PRAEPARATION
VON
BIOLOGISCHEM
MATERIAL
26
3.1
ANZUCHT
VON
NEUROSPORA
CRASSA
26
3.2
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
26
3.2.1
ISOLIERUNG
GROESSERER
MENGEN
VON
MITOCHONDRIEN
ZUR
KOMPLEX
I-PRAEPARATION
26
3.2.2
ISOLIERUNG
KLEINERER
MENGEN
VON
MITOCHONDRIEN
(FUER
ENZYMTESTS
BZW.
IMPORTEXPERIMENTE)
26
3.3
PRAEPARATION
MITOCHONDRIALER
MEMBRANEN
27
3.4
PRAEPARATION
VON
PENTAN-EXTRAHIERTEN
MITOCHONDRIALEN
PARTIKELN
27
3.5
FRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
UND
MITOCHONDRIALEN
MEMBRANEN
27
3.6
ISOLIERUNG
VON
KOMPLEX
I
AUS
NEUROSPORA
CRASSA
MITOCHONDRIEN
28
3.7
EINBAU
DES
ISOLIERTEN
KOMPLEX
I
IN
GEMISCHTE
MICELLEN
28
3.8
FRAKTIONIERUNG
DES
ISOLIERTEN
KOMPLEX
I
MIT
NABR
29
II
4.
"PROTEIN-CHEMISCHE
"
METHODEN
29
4.1
FAELLUNGSMETHODEN
FUER
PROTEINE
29
4.2
ENZYMTESTS
29
4.2.1
NADH:UBICHINON-REDUKTASE
AKTIVITAET
29
4.2.2
NADH:FERRICYANID-REDUKTASE
AKTIVITAET
30
4.3
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
30
4.3.1
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
AM
ISOLIERTEN
KOMPLEX
1
30
4.3.2
PHOTOAFFINITAETSMARKIENING
VON
MITOCHONDRIALEN
PARTIKELN
30
4.4
CHEMISCHE
QUERVEMETZUNG
VON
POLYPEPTID-UNTEREINHEITEN
31
4.5
FRI-VITRO-IMPORTEXPERIMENTE
31
4.6
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GCLELCKLROPHORCSE
(SDS-PAGE)
32
4.7
ELEKLROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROCELLULOSE
(WESTERN-BLOLT)
34
4.8
ELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
34
4.9
ELUTION
VON
PROTEINEN
AUS
NITROCELLULOSEMEMBRANEN
35
4.10
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
35
4.11
MESSUNG
VON
RADIOAKTIVEN
PROBEN
35
5.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
36
5.1
GEWINNUNG
VON
POLYKLONALEM
KANINCHEN-ANTISERUM
36
5.2
IMMUNREINIGUNG
VON
ANTISEREN
36
5.3
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
(IMMUNDEKORATION)
37
5.4
IMMUNTAELLUNG
VON
PROTEINEN
37
5.4.1
IMMUNFAELLUNG
DES
GESAMTKOMPLEXES
37
5.4.2
IMMUNTAELLUNG
EINZELNER
POLYPEPTID-UNTEREINHEITEN
38
6.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
38
6.1
INFEKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
LAMBDA-PHAGEN
38
6.2
DURCHMUSTERUNG
EINER
XGTLL
EXPRIMIERENDEN
CDNA-GENBANK
MIT
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN
38
6.3
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
39
6.4
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
40
6.4.1
MINIPRAEPARATION
("CTAB
MINIPRAEP
"
)
40
6.4.2
MIDIPRAEPARATION
40
6.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
41
6.6
LIGATION
VON
VEKTOR-DNA
UND
DNA-FRAGMENTEN
41
6.7
TRANSFORMATION
VON
.
COII-ZELLEN
MIT
REKOMBINANTER
PLASMID-DNA
42
6.8
ANALYSE
ISOLIERTER
DNA
42
6.8.1
DNA-VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
42
6.8.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
42
6.9
DNA-SEQUENZIERUNG
43
6.9.1
SEQUENZIERUNGSREAKTION
43
6.9.2
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
43
6.9.3
TRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUF
POLYACRYIAMIDGEIEN
44
6.10
TRANSKRIPTION
UND
TRANSLATION
IN-VITRO
45
III
IV.
ERGEBNISSE
46
1.
CHEMISCHE
SYNTHESE
DER
UBICHINON
UND
CAPSAICIN-DERIVATE
46
1.1
SYNTHESE
DES
UBICHINON-DERIVATS
OGCSSARNOJCG
48
1.2
SYNTHESE
DER
UBICHINON-DERIVATE
Q
Q
C
J
A
T
NO
J
UND
Q
Q
C
J
A
T
N
J
49
1.3
SPEKTROSKOPISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
UBICHINON
DERIVATS
OGCYARN^
51
1.4
SYNTHESE
DER
CAPSAICIN-DERIVATE
53
1.5
SPEKTROSKOPISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
CAPSAICIN-DERIVATS
VACJARNJ
53
2.
ENZYMATISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
UBICHINON-DERIVATE
56
2.1
ENZYMATISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
OGCJARNC^CG
56
2.2
ENZYMATISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
OGCYARNOJ
UND
QGCJARNG
57
2.3
DIE
WIRKUNG
VON
INHIBITOREN
SOWIE
VON
DETERGENTIEN
AUF
DIE
NADH:UBICHINON
REDUKTASE-AKTIVITAET
60
3.
LOKALISIERUNG
DER
UBICHINON-BINDUNGSSTELLE
DURCH
PHOTOAFFLNITAETS
MARKIERUNG
MIT
DEM
UBICHINON-DERIVAT
I^S
I
-Q
Q
C
J
A
T
N
J
64
3.1
PHOTOMARKIERUNG
AM
ISOLIERTEN
KOMPLEX
I
64
3.2
PHOTOMARKIERUNG
DES
KOMPLEX
I
IN
GEMISCHTEN
MICELLEN
69
3.3
PHOTOMARKIERUNG
IN
MITOCHONDRIALEN
MEMBRANEN
70
4.
SPEZIFITAETSSTUDIEN
73
4.1
KOMPETITION
AN
DER
UBICHINON-BINDUNGSSTELLE
73
4.2
PHOTOMARKIERUNG
MIT
DEM
CAPSAICIN-DERIVAT
-^I-VAC^ARNSS
AM
ISOLIERTEN
KOMPLEX
I
76
5.
IDENTIFIZIERUNG
DER
AN
DER
UBICHINON-BINDUNGSTELLE
BETEILIGTEN
UNTEREINHEIT
79
5.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
UBICHINON-BINDENDEN
UNTEREINHEIT
MITTELS
EINES
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERS
79
5.2
ZUORDNUNG
DES
RELEVANTEN
CDNA-KLONS
ZUM
UBICHINON-BINDENDEN
PROTEIN
80
6.
CHARAKTERISIERUNG
DES
UBICHINON-BINDENDEN
9,5-KDA
POLYPEPTIDS
82
6.1
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA
82
6.2
NUCLEOTIDSEQUENZ
UND
PRIMAERSTRUKTUR
82
6.3
VERGLEICHENDE
SEQUENZANALYSE
84
6.4
SEKUNDAERSTRUKTURVORHERSAGEN
86
7.
TOPOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
88
7.1
VERHALTEN
DES
UBICHINON-BINDENDEN
PROTEINS
GEGENUEBER
SALZEXTRAKTION
88
7.2
CHEMISCHE
QUERVEMETZUNG
DES
PROTEINS
MIT
BENACHBARTEN
UNTEREINHEITEN
90
7.3
IMPORT
DES
IN-VITRO
SYNTHETISIERTEN
PROTEINS
IN
ISOLIERTE
MITOCHONDRIEN
91
IV
V.
DISKUSSION
93
1.
PHOTOAKTIVIERBARE
UBICHINON-DERIVATE
ALS
SUBSTRATE
DER
NADH:UBICHINON
REDUKTASE
93
2.
UEBERLEGUNGEN
ZUR
WIRKUNGSWEISE
DER
INHIBITOREN
95
3.
'
PHOTOAKTIVIERBARE
UBICHINON-DERIVATE
ALS
SPEZIFISCHE
MARKER
DER
SUBSTRAT-BINDUNGSSTELLE
97
4.
DIE
UBICHINON-BINDUNGSSTELLE
IM
KOMPLEX
I
100
5.
DIE
UBICHINON-BINDENDE
9,5-KDA
UNTEREINHEIT
ALS
KOMPONENTE
DES
KOMPLEX
I
103
6.
AUSBLICK
108
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
109
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
111 |
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