Oberflächenantigene von Leishmania mexicana Amastigoten: Identifizierung und strukturelle Charakterisierung von Glycolipiden
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1.1
LEBENSZYKLUS,
KRANKHEITSBILD
UND
KLASSIFIZIERUNG
DER
LEISHMANIEN
1
1.2
ULTRASTRUKTUR
VON
LEISHMANIEN
UND
PARASLTOPHORE
VAKUOLE
3
1.3
METACYCLOGENESE
S
L4
OBERFLAECHENANTIGENE
VON
LEISHMANIEN
6
1.4.1
DIE
METALLOPROTEASE
GP63
VON
PROMASTIGOTEN
7
1.4.2
LIPOPHOSPHOGLYCAN
(LPG)
VON
PROMASTIGOTEN
9
1.4.3
GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHOLIPIDE
(GIPLS)
VON
PROMASTIGOTEN
14
1.4.4
OBERFLAECHENANTIGENE
VON
AMASTIGOTEN
IS
1.S
BINDUNG
VON
LEISHMANIEN
AN
MAKROPHAGEN
21
1.6
AUFGABENSTELLUNG
22
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
23
2.1
CHEMIKALIEN,
SAEULENMATERIALIEN,
PROTEINE,
ENZYME
UND
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
23
2.1.1
FEINCHEMIKALIEN
UND
MATERIALIEN
23
2.1.2
SAEULENMATERIALLEN
23
2.1.3
ENZYME
UND
ANTIKOERPERKONJUGATE
23
2.2
PUFFER
UND
MEDIEN
24
2.3
MEDIEN
24
2.3.1
RPMI
1640
24
2.3.2
SDM-79
24
2.3.3
SCHNEIDERS
DROSOPHILA
MEDIUM
25
2.4
ZELLINIE
25
2.5
ISOLIERUNG
VON
L.
MEXICANA
AMASTIGOTEN
25
2.6
AXENISCHE
KULTIVIERUNG
VON
L.
MEXICANA
KULTURAMASTIGOTEN
UND
PSEUDOAMASTIGOTEN
26
2.7
KULTIVIERUNG
VON
PROMASTIGOTEN
26
2.8
GEWINNUNG
UND
INFEKTION
VON
PERITONEALMAKROPHAGEN
27
2.9
GEWINNUNG
VON
LAESIONSMAKROPHAGEN
27
2.10
VERSUCHSTIERE
28
2.11
PROTEINBESTIMMUNGEN
28
2.12
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE
28
2.13
IMMUNOBLOT
29
2.13.1
PONCEAU
S-FAERBUNG
VON
BLOTMEMBRANEN
29
2.13.2
DETEKTION
VON
ANTIGENEN
DURCH
ANTIKOERPER
30
2.13.3
DETEKTION
VON
BIOTINYLIERTEN
PROTEINEN
2.14
ELISA
2.1S
DIINNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
2.1S.1
ORCIN/^SO^-BEHANDLUNG
2.1S.2
COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG
2.1S.3
IMMUNO-DC
2.16
PHOSPHATBESTIMMUNG
2.17
IMMUNFLUORESZENZ
2.17.1
IMMUNFLUORESZENZ
MIT
LEBENDEN
LEISHMANIEN
2.17.2
IMMUNFLUORESZENZ
MIT
FIXIERTEN
LEISHMANIEN
2.17.3
IMMUNFLUORESZENZ
MIT
INFIZIERTEN
MAKROPHAGEN
2.18
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
2.19
TRYPANBLAUFAERBUNG
2.20
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTI-AMASTIGOTEN
IMMUNSEREN
2.21
ISOLIERUNG
VON
OBERFLAECHENREAKTIVEN
ANTIKOERPERN
AUS
ANTI
AMASTIGOTEN
SERUM
2.22
ISOLIERUNG
VON
ANTI-A-GLP
1
UND
ANTI-A-GLP
S
ANTIKOERPERN
2.23
OBERFLAECHENBIOTINYLIERUNG
VON
AMASTIGOTEN
2.24
HERSTELLUNG
VON
ZELLYSATEN
UND
TRITON
X-114
PHASENSEPARATION
2.24.1
ZELLYSE
IN
SDS
2.24.2
ZELLYSE
IN
TRITON
X-114
UND
PHASENSEPARATION
2.2S
PROTEINASE
K-SPALTUNG
2.26
EXTRAKTION
VON
GLYCOLIPIDEN
UND
FOLCH-PHASENSEPARATION
2.27
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
AMASTIGOTEN-GLYCOLIPIDEN
2.27.1
REINIGUNG
DURCH
PRAEPARATIVE
DIINNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
2.27.2.
PERACETYLIERUNG
UND
REINIGUNG
DURCH
ADSORPTIONS
CHROMATOGRAPHIE
2.28
BEHANDLUNG
MIT
PI-SPEZIFISCHER
PHOSPHOLIPASE
C
(B.
THURINGENSLS)
2.29
ALKALISCHE
HYDROLYSE
2.30
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
LEISHMANIEN-GLYCOLIPIDEN
MIT
I^HJ
-MYO-INOSITOL
2.31
STRUKTURAUFKLAERUNG
DER
GIPLS
2.31.1
ANALYSE
DER
GIPL-GLYCANE
VON
AMASTIGOTEN
UND
PROMASTIGOTEN
8
$
S
S
S
S
S
S
GG
DURCH
DIONEX-HPLC
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
2.31.1.1
HERSTELLUNG
EINER
PHOSPHOLIPIDARMEN
GLYCOLLPIDFRAKTION
2.31.1.2
DEAMINIERUNG
UND
NABL
3
HLH^
REDUKTION
VON
GIPL-GLYCANEN
40
2.31.1.3
TRENNUNG
DER
GLYCANE
DURCH
HPLC
41
2.31.2
STRUKTURANALYSE
VON
A-GLP
1,
2
UND
3
41
2.31.2.1
MONOSACCHARIDBESTIMMUNG
41
2.31.2.2
METHYLIERUNGSANALYSE
42
2.31.2.3
BESTIMMUNG
VON
ETHANOLAMIN
42
2.31.2.4
BEHANDLUNG
MIT
JACK
BEAN
OT-MANNOSIDASE
42
3.
ERGEBNISSE
43
3.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
OBERFLAECHENPROTEINEN
BEI
AMASTIGOTEN
43
3.
2
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
KANINCHEN
-
ANTISEREN
GEGEN
L.
MEXICANA
AMASTIGOTEN
45
3.3
ISOLIERUNG
VON
ANTI-AMASTIGOTENOBERFLAECHE
ANTIKOERPERN
47
3
3.1
SAEURESTABILITAET
VON
AMASTIGOTEN
47
3.3.2
ELUTION
DER
ANTI-AMASTIGOTENOBERFLAECHE
ANTIKOERPER
BEI
PH
2.7S
48
3.3.3
REAKTIVITAET
DER
GEREINIGTEN
ANTI-AMASTIGOTENOBERFLAECHE
ANTIKOERPER
IN
IMMUNFLUORESZENZEXPERIMENTEN
51
3.3.4
IMMUNELEKTRONENMLKROKOPISCHE
ANTIGENLOKALISATION
51
3.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
AMASTIGOTEN
OBERFLAECHENANTIGENEN
IM
IMMUNOBLOT
54
3.5
CHARAKTERISIERUNG
DES
LF-ANTIGENS
56
3.5.1
NACHWEIS
DES
LF-ANTIGENS
IN
KULTUR
UND
PSEUDOAMASTIGOTEN
56
3.5.2
PROTEINASE
K
BEHANDLUNG
57
3.5.3
EXTRAKTEN
DES
LF-ANTIGENS
MIT
ORGANISCHEM
LOESUNGSMITTEL
57
3.5.4
CHARAKTERISIERUNG
DES
LF-ANTIGENS
DURCH
IMMUNO-DIINSCHICHT
CHROMATOGRAPHIE
(
IMMUNO-DC)
59
3.6
STRUKTURELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
AMASTIGOTEN
GLYCOLIPIDEN
62
3.6.1
FRAKTIONIERUNG
DES
CMW-EXTRAKTS
DURCH
PHASENSEPARATION
NACH
FOLCH
62
3.6.2
BEHANDLUNG
MIT
PHOSPHATIDYLINOSLTOL-SPEZIFISCHER
PHOSPHOLIPASE
C
(PI-PLC)
UND
ALKALISCHE
VERSEIFUNG
64
3.6.3
MARKIERUNG
VON
AMASTIGOTEN
UND
PROMASTIGOTEN
GLYCOLIPIDEN
MIT
MYO-[
3
HJ-INOSITOL
68
3.6.4
ISOLIERUNG
DER
AMASTIGOTEN
GLYCOLIPIDE
70
3.6.5
STRUKTURANALYSE
DURCH
FAST-ATOM-BOMBARDMENT-MASS
SPECTROSCOPY
71
3.6.6
STRUKTURANALYSE
DER
GIPLS
VON
AMASTIGOTEN
75
3.6.6.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
AMASTIGOTEN
UND
PROMASTIGOTEN
GIPLS
DURCH
DIONEX
HPLC
75
3.6.6.2
STRUKTURANALYSE
VON
A-GLP
1,
2,
UND
3
79
3.6.6.2.1
KOMPONENTEN-ANALYSE
79
3.6.6.2.2
METHYLIERUNGSANALYSE
80
3.6.7
QUANTIFIZIERUNG
83
3.6.8
CHARAKTERISIERUNG
VON
A-GLP
5
DURCH
IMMUNO-DC
MIT
EINEM
MONOKLONALEM
ANTI-FORSSMAN-ANTIKOERPER
84
3.7
A-GLP
5,
EIN
MAKROPHAGENPRODUKT
86
3.8
NACHWEIS
VON
A
GLP
5
IN
PERITONEALMAKROPHAGEN
87
3.9
HERSTELLUNG
VON
AFFINITAETSGEREINIGTEN
ANTI-A-GLP
5
UND
ANTI-A-GLP
1
ANTIKOERPERN
88
3.10
LOKALISIERUNG
VON
A
GLP
5
UND
A
GLP
1
MIT
AFFINITAETSGEREINIGTEN
ANTI
A
GLP
S
UND
ANTI
A
GLP
1
ANTIKOERPERN
90
3.10.1
IMMUNFLUORESZENZEXPERIMENTE
AN
LAESIONS
UND
KULTURAMASTLGOTEN
90
3.10.2
INUNUNELEKTRONENMIKROSKOPIE
AN
LAESIONSAMASTLGOTEN
93
3.10.3
LOKALISIERUNG
VON
A-GLP
S
UND
A-GLP
1
IN
INFIZIERTEN
MAKROPHAGEN
95
4.
DISKUSSION
99
4.1
ISOLIERUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTI-AMASTIGOTENOBERFLAECHE
(ANTI-AO)
ANTIKOERPERN
99
4.2
IDENTIFIZIERUNG
DER
GLYCOLIPIDE
A-GLP
1
UND
A-GLP
S
AUF
DER
OBERFLAECHE
VON
LAESIONSAMASTLGOTEN
102
4.3
LPG
IN
AMASTIGOTEN
103
4.4
GP63
IN
AMASTIGOTEN
104
4.5
SIND
GIPLS
DIE
EINZIGEN,
IN
HOEHERER
KOPIENZAHL
AUF
DER
OBERFLAECHE
VORKOMMENDEN
ANTIGENE
?
106
4.6
GIPLS
VON
LEISHMANIEN
:
STRUKTUR
UND
MOEGLICHE
FUNKTION
IN
AMASTIGOTEN
107
4.7
DAS
A-GLP
S-ANTIGEN
111
S.
ZUSAMMENFASSUNG
115
6.
LITERATURVERZEICHNIS
117 |
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