Einfluss verschiedener NCAM-Varianten auf die Zelladhäsion und das Wachstum von Axonen:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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| Beschreibung: | [10], 150 S. Ill., graph. Darst. |
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GLIEDERUNG
SEITE
ABKUERZUNGEN
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
7
2.1.
MATERIAL
7
2.1.1.
BIOLOGISCHE
SICHERHEIT
7
2.1.2.
VERSUCHSTIERE
7
2.1.3.
ZELLINIEN
7
2.1.4.
BAKTERIENSTAEMME
7
2.1.5.
VEKTOREN
7
2.1.6.
GERAETE
UND
ZUBEHOER
8
2.1.7.
ENZYME
10
2.1.8.
ANTIKOERPER
10
2.1.9.
CHEMIKALIEN
11
2.1.10.
STAMMLOESUNGEN
UND
PUFFER
11
2.1.11.
KULTURMEDIEN
UND
PLATTEN
13
2.1.11.1.
BAKTERIENMEDIEN
13
2.1.11.2.
ZELLKULTURMEDIEN
13
2.1.12.
STERILISATION
DER
MATERIALIEN
14
2.2.
METHODEN
15
2.2.1.
NUCLEINSAEUREN
15
2.2.1.1.
HANDHABUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
15
2.2.I.2.
NUDEINSAEURE-PRAEPARATIONEN
15
2.2.1.2.1.
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
I
15
2.2.I.2.2.
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
II
16
2.2.1.2.3.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
16
2.2.I.2.4.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
17
2.2.1.2.5.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
FUER
PRAEPARATIVE
ZWECKE
17
2.2.I.2.6.
PRAEPARATION
VON
M13-EINZELSTRANG-DNA
17
2.2.1.3.
RESTRIKTIONSVERDAU
18
2.2.1.4.
GELELEKTROPHORESEN
18
2.2.1.4.1.
NATIVE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
18
2.2.1.4.2.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
18
2.2.1.5.
ISOLATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
20
2.2.1.5.1.
ELUTION
MIT
DER
LONENAUSTAUSCHERMEMBRAN
DEAE-NA45
20
2.2.1.5.2.
ELEKTROELUTION
MIT
DER
BIOTRAP-KAMMER
20
2.2.1.5.3.
ELUTION
RADIOAKTIV
MARKIERTER
EINZELSTRANG-DNA
AUS
PAA-GELEN
21
2.2.1.6.
UMKLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
21
2.2.1.6.1.
LIGATION
21
2.2.1.6.2.
TRANSFORMATION
22
2.2.1.6.2.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
22
2.2.1.6.2.2.
TRANSFORMATION
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
22
2.2.I.6.3.
IDENTIFIKATION
REKOMBINANTER
KLONE
23
2.2.1.7.
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
NUDEINSAEUREN
23
2.2.1.7.1,
TRANSFER
VON
NUDEINSAEUREN
AUF
FILTER
23
2.2.I.7.I.1.
SOUTHERN
BLOT
23
2.2.1.7.1.2.
KOLONIE-TRANSFER
24
2.2.1.7.2.
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
DNA
24
2.2.1.7.3.
DEHYBRIDISIERUNG
25
2.2.1.8.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NUDEINSAEUREN
25
2.2.1.8.1.
RANDOM
PRIMING
25
2.2.1.8.2.
PRIMER
EXTENSION
26
2.2.I.9.
NUDEASE-S1-SCHUTZEXPERIMENT
26
2.2.1.9.1.
HERSTELLUNG
EINER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
EINZELSTRANG-DNA-PROBE
26
2.2.1.9.2.
HYBRIDISIERUNG
DER
MARKIERTEN
EINZELSTRANG-PROBE
MIT
RNA
28
2.2.1.9.3.
NUDEASE-SL-VERDAU
UND
ANALYSE
DER
HYBRIDE
29
2.2.2.
PROTEINE
30
2.2.2.1.
PRAEPARATION
UND
MODIFIKATION
VON
ZELLMEMBRANFRAGMENTEN
30
2.2.2.1.1.
PRAEPARATION
VON
MEMBRANFRAGMENTEN
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
30
2.2.2.1.2.
BEHANDLUNG
DER
MEMBRANEN
MIT
ENDONEURAMINIDASE
31
2.2.2.2.
HERSTELLUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
31
2.2.2.3.
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
IN
HOMOGENATEN
32
2.2.2.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
32
2.2.2.5.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
34
2.2.26.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
35
2.2.2.6.1.
TRANSFER
DER
PROTEINE
AUF
EINE
MEMBRAN
35
2.2.2.6.2.
GESAMTPROTEINFAERBUNG
36
2.2.2.6
.3.
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
PROTEINE
DURCH
ANTIKOERPERFAERBUNG
36
2.2.2.7.
ELISA
37
2.2.3.
ZELKULTUR
39
2.2.3.1.
2.2.3.2.
2.2.3.3.
2.2.3.3.1.
2.2.3.3.2.
ROUTINEMETHODEN
39
GENERATIONSZELTBESTIMMUNG
40
TRANSFEKTION
40
ELEKTROPORATION
40
SELEKTION
41
2.2.4.
FAERBUNGEN
41
2.2.4.I.
2.2.4.2.
IMMUNFLUORESZENZ-FAERBUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
41
HISTOCHEMISCHE
FAERBUNG
ZUM
NACHWEIS
VON
SS-GALAKTOSIDASE
IN
42
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
2.2.4.3.
2.2.4.4.
2.2.4.5.
FAERBUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
MIT
DII/DIO
43
FAERBUNG
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
MIT
BISBENZIMID
43
TRYPTANBLAU-FAERBUNG
43
2.2.5.
AGGREGATLONSASSAYS
44
2.2.5.1.
2.2.5.2.
2.2.5.3.
HERSTELLEN
EINER
EINZELZELLSUSPENSION
44
QUANTIFIZIERUNG
DER
AGGREGATBILDUNG
44
BESTIMMUNG
DER
AGGREGATZUSAMMENSETZUNG
IN
CBKULTUREN
45
2.2.B.
ASSAYS
ZUR
UNTERSUCHUNG
DES
AXONALEN
WACHSTUMS
RETINALER
45
GANGLIENZELLEN
2.2.6.1.
2.2.6.2.
2.2.6.3.
2.2.6.3.1.
PRAEPARATION
VON
RETINA-EXPLANTATSTREIFEN
45
UNTERSUCHUNG
DES
AXONALEN
WACHSTUMS
AUF
ZELL-MONOLAYEM
46
ENTSCHEIDUNGSASSAY
46
BESCHICHTUNG
VON
NUDEOPOREFILTEM
MIT
ALTERNIERENDEN
47
MEMBRANSTREIFEN
2.2.6.3.2.
VERSUCHSANORDNUNG
FUR
DEN
ENTSCHEIDUNGSASSAY
48
3.
ERGEBNISSE
49
3.1.
ZIELSETZUNG
UND
STRATEGIE
49
3.2.
HERSTELLUNG
NCAM-EXPRIMLERENDER
RBROBLASTEN-ZELLINLEN
51
3.2.1.
KONSTRUKTE
51
3.2.1.1.
KLONIERUNG
VON
NCAM120:
TC
+
,
A,A
IN
PRC/CMV
51
3.2.1.2.
KLONIERUNG
WEITERER
NCAM
TC
+
-FORMEN
IN
PRC/CMV
53
3.2.1.3.
KLONIERUNG
VON
NCAM
N~-FORMEN
IN
PRC/CMV
53
3.2.1.4.
KLONIERUNG
VON
NCAM140:
LT
+
,
A-IOS
IN
PRC/CMV
53
3.2.1.5.
ZUSAMMENSTELLUNG
DER
VORLIEGENDEN
CMV-NCAM-KONSTRUKTE
53
3.2.2.
TRANSFEKTION
VON
NCAM-NEGATIVEN
MAUS-HBROBLASTEN
(LMTK~)
59
3.2.2.1.
AUSWAHL
DER
ZELLEN
59
3.2.2.2.
TRANSFEKTIONEN
60
3.3.
CHARAKTERISIERUNG
NCAM-EXPRIMIERENDER
L-ZELL-TRANSFEKTANDEN
65
3.3.1.
NACHWEIS
DES
TRANSGENS
65
3.3.2.
NACHWEIS
DES
NCAM-TRANSKRIPTS
66
3.3.3.
NACHWEIS
DES
NCAM-PROTEINS
69
3.3.4.
NACHWEIS
VON
NCAM
IM
KULTURMEDIUM
VON
L-ZELL-TRANSFEKTANDEN
71
3.3.5.
SENSITIVITAET
VON
NCAM
GEGENUEBER
TRYPSIN
UND
EDTA
73
3.3.6.
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
NCAM-MENGE
AUF
DER
OBERFLAECHE
74
TRANSFIZIERTER
L-ZELLEN
3.3.7.
VERGLEICH
DER
GENERATIONSZEITEN
VON
L-ZELL-TRANSFEKTANDEN
76
3.4.
ANALYSE
DER
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
NCAM-TRANAFIZLERTER
L-ZESSEN
77
3.4.1.
AGGREGATIONSKINETIK
NCAM-EXPRIMLERENDER
L-ZELL-TRANSFEKTANDEN
77
IM
VERGLEICH
ZU
VEKTOR-TRANSFIZIERTEN
KONTROLL-ZELLEN
3.4.2.
VERGLEICH
DER
AGGREGATIONSRATEN
VON
L-ZELL-TRANSFEKTANDEN
79
3.4.3.
ADHAESIONSSPEZIFITAET
VON
NCAM-FORMEN
82
3.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EBTFLUB
EINZELNER
NCAM-FORMEN
AUF
88
WACHSTUM
UND
ORIONTIERUNGSVORHALTEN
VON
AXONEN
3.5.1.
EINFLUSS
EINZELNER
NCAM-FORMEN
AUF
DAS
AUSWACHSEN
VON
AXONEN
88
RETINALER
GANGLIENZELLEN
3.5.2.
EINFLUSS
EINZELNER
NCAM-FORMEN
AUF
DAS
ORIENTIERUNGSVERHALTEN
95
VON
AXONEN
3.5.3.
EINFLUSS
VON
POLYSIALINSAEURE
AUF
DAS
ORIENTIERUNGSVERHALTEN
108
VON
AXONEN
4.
DISKUSSION
112
5.
ZUSAMMENFASSUNG
130
6.
LITERATUR
131 |
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