Interaktion von Decorin mit Molekülen der extrazellulären Matrix: Einfluß auf die Zelladhäsion
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG . 1
1.1. WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN ZELLEN UND DER EXTRAZELLULAEREN
MATRIX. 1
1.1.1. EXTRAZELLULAERE MATRIX .
1
1.1.2. INTEGRINE.
2
1.1.3. ZELLADHAESION .
2
1.1.3.1. GRUNDLEGENDE VORGAENGE BEI DER ZELLADHAESION. 3
1.1.3.2. MODULATION DER ZELLADHAESION .
5
1.2. GLYKOPROTEINE DER EXTRAZELLULAEREN MATRIX. 6
1.2.1. FIBRONEKTIN.
6
1.2.1.1. STRUKTUR, VORKOMMEN UND EIGENSCHAFTEN VON FIBRONEKTIN. 6
1.2.1.2. FUNKTIONEN VON FIBRONEKTIN . 9
1.2.2. THROMBOSPONDIN. 19
1.2.2.1. STRUKTUR, VORKOMMEN UND EIGENSCHAFTEN VON THROMBO
SPONDIN . 19
1.2.2.2. FUNKTIONEN VON THROMBOSPONDIN.'. 12
1.3. PROTEOGLYKANE. 13
1.3.1. STRUKTUR, VORKOMMEN UND EIGENSCHAFTEN VON PROTEOGLYKANEN
. 13
1.3.2. DECORIN. 1
1.3.2.1. FUNKTIONEN VON DECORIN. 18
1.3.2.2. INTERAKTIONEN ZWISCHEN DECORIN UND FIBRONEKTIN . 19
2. PROBLEMSTELLUNG . 20
3. EXPERIMENTELLE METHODEN
. 21
3.1. ZELLKULTUR. 21
3.1.1.
LANGZEITKULTUREN
VON
MENSCHLICHEN
HAUTFIBROBLASTEN. 21
3.1.2. METABOLISCHE MARKIERUNGEN. 22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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SEITE
3.2. DARSTELLUNG VON EXTRAZELLULAEREN MATRIXKOMPONENTEN. 22
3.2.1. DARSTELLUNG VON DECORIN. 22
3.2.1.1. DARSTELLUNG VON DECORIN UND GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN
DURCH ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE . 23
3.2.1.2. DARSTELLUNG VON DECORIN UND GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN AN
EINER HPLC-DEAE (DIETHYLAMINOETHYLEN)-MATRIX . 24
3.2.1.3. DARSTELLUNG VON SYNTHETISCHEN PEPTIDEN MIT SEQUENZEN DES
DECORIN-CORE-PROTEINS. 25
3.2.2. DARSTELLUNG VON FIBRONEKTIN. 26
3.2.2.1. ERZEUGUNG UND DARSTELLUNG VON FIBRONEKTIN-FRAGMENTEN. 27
3.2.3. DARSTELLUNG VON THROMBOSPONDIN. 27
3.2.3.1. DARSTELLUNG VON THROMBOSPONDIN AUS SCHWEINEENDOTHEL
ZELLEN . 28
3.2.3.2. DARSTELLUNG VON THROMBOSPONDIN AUS BLUTPLAETTCHEN. 29
3.2.3.3. ERZEUGUNG UND DARSTELLUNG EINES HEPARIN-BINDENDEN THROM-
BOSPONDIN-FRAGMENTS . 30
3.3. HERSTELLUNG VON AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE-MATRIZES. 30
3.3.1. KOPPLUNG VON THROMBOSPONDIN AN SEPHAROSE CL-4B . 30
3.3.2. KOPPLUNG VON BSA AN SEPHAROSE CL-4B . 31
3.4. SYNTHESE MEMBRANGEBUNDENER PEPTIDE. 31
3.5. IMMUNPRAEZIPITATION . 34
3.6. NACHWEIS VON WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DECORIN UND
GLYKOPROTEINEN . 35
3.6.1. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS. 36
3.6.1.1. IMMUNADSORPTIONSTEST (ELISA). 36
3.6.1.2. ADSORPTIONSTEST AN IMMUNPRAEZIPITIERTEM FIBRONEKTIN. 37
3.6.2. NACHWEIS MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN LIGANDEN . 38
3.6.2.1. ADSORPTIONSTEST MIT AUF MIKROTITERPLATTEN IMMOBILISIERTEN
GLYKOPROTEINEN UND MARKIERTEM DECORIN. 38
3.6.2.2. ADSORPTIONSTEST MIT RADIOAKTIV MARKIERTEM DECORIN UND ELEK-
TROTRANSFERIERTEN PROTEINEN. 38
3.6.2.3. ADSORPTIONSTEST AN THROMBOSPONDIN-SEPHAROSE . 39
3.7. ZELLADHAESION. 39
3.7.1. QUANTIFIZIERUNG ADHAERENTER ZELLEN. 41
3.7.1.1. QUANTIFIZIERUNG DURCH ZELLZAEHLUNG. 41
3.7.1.2. QUANTIFIZIERUNG DURCH MESSUNG INKORPORIERTEN [
3H]-LEUCINS . 41
3.7.1.3. QUANTIFIZIERUNG DURCH COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG . 41
SEITE
3.8. NACHWEIS UND CHARAKTERISIERUNG VON PROTEOGLYKANEN UND
PROTEINEN . 42
3.8.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) . 42
3.8.2. ELEKTROTRANSFER. 43
3.8.2.1. SEMI-TROCKENBLOT . 43
3.8.2.2. NASSBLOT . 44
3.8.3. RADIOLOGISCHER NACHWEIS. 44
3.8.3.1. RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNG. 44
3.8.3.2. FIUOROGRAPHIE. 45
3.8.3.3. AUTORADIOGRAPHIE. 45
3.8.4. IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS. 45
3.8.4.1. IMMUNTEST NACH ELEKTROTRANSFER (IMMUNOBLOT) . 45
3.8.4.2. IMMUNTEST VON IMMOBILISIERTEN SUBSTRATEN AUF MIKROTITER
PLATTEN . 46
3.8.5. PHOTOMETRISCHER NACHWEIS. 46
3.8.5.1. URONSAEUREBESTIMMUNG. 46
3.8.5.2. PROTEINBESTIMMUNG. 46
3.8.6. FAERBEMETHODEN. 47
3.8.6.1. SILBERFAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN . 47
3.8.6.2. COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN. 47
3.8.6.3. AMIDOSCHWARZFAERBUNG VON MEMBRANEN . 48
3.8.6.4. COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG VON MEMBRANEN. 48
3.8.6.5. GOLDFAERBUNG VON MEMBRANEN. 48
3.9. ENZYMATISCHE UND CHEMISCHE SPALTUNGEN . 48
3.9.1. ABBAU MIT CHONDROITIN-ABC-LYASE. 48
3.9.2. ABBAU MIT ENDOPROTEINASE GLU-C. 49
3.9.3. ABBAU MIT CYANBROMID . 49
3.9.4. SS-ELIMINATION. 50
3.10. ALKYLIERUNG VON SH-GRUPPEN . 50
3.11. MATERIAL . 51
3.12. GERAETE . 55
SEITE
4. ERGEBNISSE .
56
4.1. DARSTELLUNG VON KOMPONENTEN DER EXTRAZELLUIAEREN MATRIX. 56
4.1.1. UEBERPRUEFUNG DER DARSTELLUNG VON DECORIN. 56
4.1.2. UEBERPRUEFUNG DER DARSTELLUNG VON FIBRONEKTIN UND SEINER
FRAGMENTE . 58
4.1.3. UEBERPRUEFUNG DER DARSTELLUNG VON THROMBOSPONDIN UND SEINER
FRAGMENTE . 59
4.2. UEBERPRUEFUNG VON METHODEN FUER ZELLADHAESIONSEXPERIMENTE. 60
4.2.1. UEBERPRUEFUNG EINER METHODE ZUR QUANTIFIZIERUNG ADHAERENTER
ZELLEN. 64
4.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DECORIN UND
THROMBOSPONDIN. 66
4.3.1. WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DECORIN UND VERSCHIEDENEN
THROMBOSPONDIN-FORMEN. 66
4.3.2. QUANTIFIZIERUNG DER WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DECORIN UND
THROMBOSPONDIN. 68
4.3.3. BINDUNG VON DECORIN AN THROMBOSPONDIN-SEPHAROSE . 72
4.3.4. EINFLUSS VON GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN AUF DIE WECHSELWIR
KUNG ZWISCHEN DECORIN UND THROMBOSPONDIN BEZIEHUNGS
WEISE THROMBOSPONDIN-FRAGMENTEN. 76
4.3.5. EINFLUSS DER THROMBOSPONDIN-DECORIN-WECHSELWIRKUNG AUF DIE
ADHAESION VON FIBROBLASTEN. 79
4.4. UNTERSUCHUNGEN ZUR WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DECORIN UND
FIBRONEKTIN. 82
4.4.1.
EINFLUSS VON DECORIN AUF DIE ADHAESION VON FIBROBLASTEN. 82
4.4.2. EINFLUSS DES DECORIN-CORE-PROTEINS UND VON GLYKOSAMINO
GLYKAN-KETTEN AUF DIE ADHAESION VON FIBROBLASTEN . 83
4.4.3. UNTERSUCHUNGEN ZUR WIRKUNGSWEISE VON DECORIN AUF DIE
HEMMUNG DER ADHAESION VON FIBROBLASTEN. 89
4.4.4. LOKALISATION DER MIT DECORIN INTERAGIERENDEN BINDUNGSSTELLEN
VON FIBRONEKTIN. 91
4.4.4.1. EINFLUSS VON DECORIN AUF DIE ADHAESION VON ZELLEN AUF IMMOBILI
SIERTEN FIBRONEKTIN-FRAGMENTEN . 91
4.4.4.2. IN VITRO-UNTERSUCHUNGEN ZUR WECHSELWIRKUNG ZWISCHEN DECO
RIN UND FIBRONEKTIN-FRAGMENTEN. 93
4.4.5. LOKALISATION DER FUER DIE HEMMUNG DER FIBROBLASTENADHAESION
VERANTWORTLICHEN BINDUNGSSTELLE VON DECORIN. 96
4
.4.5.1, EINFLUSS VON REDUZIERTEM UND ALKYLIERTEM DECORIN . 96
4.4.5.2. EINFLUSS EINES SYNTHETISCHEN PENTAPEPTIDS . 98
SEITE
4.4.5.3. EINFLUSS VON ANTIKOERPER-DECORIN-KOMPLEXEN . 98
4.4.5.4. BINDUNG VON DECORIN-CNBR-SPALTPRODUKTEN AN FIBRONEKTIN. 99
4.4.5.5. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG EINES FIBRONEKTIN-BINDENDEN
DECORIN-FRAGMENTS . 102
4.4.6. LOKALISATION DER MIT EINEM MONOKLONALEN ANTIKOERPER INTER
AGIERENDEN BINDUNGSSTELLE . 105
5. DISKUSSION . 107
6. ZUSAMMENFASSUNG . 132
7. LITERATURVERZEICHNIS. 135
LEBENSLAUF UND BILDUNGSGANG |
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