Negative Regulation der Transkription bei genitalen und kutanen humanen Papillomviren:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
ZUSAMMENFASSUNG
1
N.
EINLEITUNG
3
HI.
MATERIAL
10
1.
EUKARYONTE
ZELLEN
10
2.
BAKTERIEN
10
3.
NUKLEINSAEUREN
11
3.1.
SYNTHETISCH
HERGESTELLTE
OLIGONUKLEOTIDE
11
3.2.
REKOMBINANTE
PLASMIDE
12
3.3.
GROESSENSTANDARDS
16
3.4.
SONSTIGE
NATUERLICHE
NUKLEINSAEUREN
16
4.
ENZYME
16
4.1.
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
16
4.2.
SONSTIGE
ENZYME
17
5.
FERTIGE
REAGENZIENSYSTEME
(KITS)
17
6.
REAGENZIEN
18
7.
MEDIEN
18
7.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
18
7.2.
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
19
IV.
METHODEN
21
1.
ZELLKULTUR
21
1.1.
MONOLAYERKULTUREN
21
1.2.
LANGZEITLAGERUNG
VON
ZELLEN
21
1.3.
TRANSFEKTION
EUKARYONTER
ZELLEN
22
2.
BAKTERIENKULTUR
22
2.1.
KULTUREN
FUER
PLASMIDISOLIERUNGEN
22
2.2.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
23
3.
DNA-METHODEN
23
3.1.
STANDARDMETHODEN
23
3.2.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
25
3.3.
DNA-SEQUENZIERUNG
25
3.4.
RADIOAKTIVE
DNA-MARKIERUNG
25
3.5.
AUFREINIGUNG
UND
REANNEALING
VON
EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDEN
26
3.6.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
26
4.
RNA-METHODEN
27
4.1.
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
EUKARYONTEN
ZELLEN
27
4.2.
RNASE-PROTEKTIONS-ANALYSE
27
5.
TRANSIENTE
EXPRESSIONSTESTS
29
5.1.
CAT-ANALYSE
29
5.2.
LUCIFERASE-EXPRESSIONSTEST
30
6.
PROTEIN-METHODEN
31
6.1.
KEMPROTEIN-EXTRAKTION
AUS
ZELLKULTUREN
31
6.2.
IN
VITRO
SYNTHESE
VON
PROTEINEN
32
6.3.
EXPRESSION
DES
HIS-YYL-FUSIONSPROTEINS
UND
REINIGUNG
DURCH
AFFMITAETSCHROMATOGRAPHIE
33
6.4.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
(SDS-PAGE)
34
6.5.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
35
7.
DNA-PROTEIN
BINDUNGS-TESTS
35
7.1.
DNASEL-FOOTPRINT
35
7.2.
GEL-RETARDATIONS-EXPERIMENTE
("BAND-SHIFT-TESTS")
,
36
8.
COMPUTERUNTERSTUETZTE
SEQUENZANALYSEN
37
V.
ERGEBNISSE
38
A
NEGATIVE
REGULATION
DER
TRANSKRIPTION
BEIM
GENITALEN
PAPILLOMVIRUS
HPV16
38
1.
AKTIVIERUNG
DES
FRUEHEN
PROMOTORS
VON
HPV
16
DURCH
EINE
IN
VIVO
DELETION
IN
DER
LANGEN
KONTROLLREGION
38
2.
REPRESSION
DER
HPV16-GENEXPRESSION
DURCH
EINEN
YYL-AB
HAENGIGEN
SILENCER
40
3.
CHARAKTERISIERUNG
EINER
IN
VIVO
AUFGETRETENEN
PUNKTMUTATION
IN
DER
HPV16
YYL-BINDESTELLE
2
47
B
NEGATIVE
REGULATION
DER
TRANSKRIPTION
BEIM
KUTANEN
PAPILLOMVIRUS
HPV8
48
1.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DES
NRE-MOTIVS
48
2.
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINES
ZWEITEN,
CIS-AKTIVEN,
NEGATIVEN
ELEMENTS
STROMAUFWAERTS
ZUM
FRUEHEN
HPV8-PROMOTOR
P
173
52
3.
NACHWEIS
EINER
NEGATIV-REGULATORISCHEN
AKTIVITAET
DER
NRE
UND
M29
SEQUENZEN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLEN
54
4.
INTERAKTIONEN
DES
HPV8-NRE
UND
M29-MOTIVS
MIT
KEMPROTEINEN
55
5.
DAS
ZELLULAERE
REPRESSORPROTEIN
YY1
(HUCRBP)
BINDET
NICHT
AN
DIE
NEGATIVEN
HPV8-KONTROLLELEMENTE
NRE
UND
M29
59
6.
FUNKTIONELLE
ANALYSE
DER
NRE-MUTANTEN
61
7.
REGULATION
DER
SILENCER-AKTIVITAET
DES
NRE-MOTIVS
DURCH
DEN
VIRALEN
TRANY-AKTIVATOR
E2
64
VI.
DISKUSSION
67
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
75
VIII.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
92 |
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