Herstellung und Reinigung von Mutanten des humanen Annexin V, einem in vitro spannungsgesteuerten Calciumkanal, und deren strukturelle Charakterisierung:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
2
2.1.
DAS
ELEMENT CALCIUM
UND
SEINE
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
2
2.2.
DIE
CALCIUM-HOMOEOSTASE
2
2.3.
CALCIUM-KANAELE
3
2.4.
CALCIUM-BINDENDE
PROTEINE
5
2.4.1.
CALCIUM-BINDENDE
PROTEINE
DER
"EF-HAND"-FAMILIE
5
2.4.2.
CALCIUM-BINDENDE
PROTEINE
DER
ANNEXIN-FAMILIE
5
2.4.2.1
DIE
EIGENSCHAFTEN
DERANNEXINE
6
2.4.22
DIE
STRUKTUR
VON
ANNEXIN
V
UND
DEREN
BEDEUTUNG
FUER
DIE
FUNKTION
9
2.5.
VORSTELLUNGEN
UEBER
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
LONENKANAELEN
12
2.6.
PROBLEMSTELLUNG
16
3.
MATERIALIEN
UND
GERAETE
17
3.1.
BAKTERIEN
17
3.2.
PLASMIDE
UND
PHAGEMIDS
17
3.3.
PHAGEN
19
3.4.
ENZYME
19
3.4.1.
RESTRIKTIONSENZYME
19
3.4.2.
ANDERE
ENZYME
19
3.5.
OLIGONUKLEOTIDE
19
3.5.1.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
MUTAGENESE
19
3.5.2.
OLIGONUKLEOTIDE
FUER
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
20
3.6.
CHEMIKALIEN,
MATERIALIEN
UND
GERAETE
20
3.7.
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
23
3.8.
LOESUNGEN
FUER
DIE
PAGE
UND
SILBERFAERBUNG
MIT
DEM
PHAST-SYSTEM
24
3.8.1.
VORRATSLOESUNGEN
FUER
PAA-GELE
UND
DEREN
ZUSAMMENSETZUNG
24
3.8.2.
VORRATSLOESUNGEN
ZUR
SILBERFAERBUNG
MIT
DEM
PHAST-SYSTEM
VON
PHARMACIA
24
3.9.
PUFFER
FUER
DIE
RESTRIKTIONSFRAGMENTISOLIERUNG
25
II
4.
METHODEN
28
4.1.
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
28
4.1.1.
VERMEHRUNG
VON
BAKTERIEN
28
4.1.1.1
PLATTENKULTUREN
28
4.1.12
FLUESSIGKULTUREN
28
4.1.13
FERMENTATION
VON
E.
COLI
28
4.1.2.
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
29
4.1.3.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
30
4.1.4.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
30
4.2.
ARBEITEN
MIT
DNA
31
4.2.1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
DNA
31
42.1.1
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
31
42.1.2
DNA-SEQUENZIERUNG
31
4.2.1.2.1
DURCHFUEHRUNG
DER
SEQUENZREAKTIONEN
31
4.2.1.22
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
33
4.2.2.
VERMEHRUNG
UND
PRAEPARATION
VON
DNA
UND
DNA-FRAGMENTEN
33
4.22.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
FUER
DIE
SEQUENZIERUNG
33
42.22
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
34
4.2.2
3
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
35
4.2.2.4
ISOLIERUNG
VOM
DNA
-FRAGMENTEN
35
4.2.3.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
AN
DNA
36
4.23.1
VERDAU
DER
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
36
4.2
3.2
BEHANDLUNG
MIT
A
IKALISCHER
PHOSPHATASE
36
4233
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
36
423.4
HERSTELLUNG
VON
GLATTEN
ENDEN
("BLUNT
END")
37
42.33
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
37
4.2.4.
DIE
MUTAGENESE
NACH
KUNKEL
38
42.4.1
VORBEREITUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
39
4.2.42
PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
39
42.43
ANZUCHT
VON
PHAGEN
MIT
URACILHALTIGER
DNA
39
42.4.4
ISOLATION
VON
EINZELSTRAENGIGER
DNA
41
42.43
ANNEALING
DES
MUTAGENEN
OLIGONUKLEOTIDS
UND
SYNTHESE
DES
KOMPLEMENTAEREN
STRANGES
41
4.3.
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
43
4.3.1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
43
43.1.1
DISKONTINUIERLICHE
GELELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
43
43.1.2
PROTEINBESTIMMUNG
DURCH
ULTRAVIOLETTSPEKTROSKOPIE
44
4.3.2.
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
44
4.3.3.
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
ANNEXIN
V
UND
SEINER
MUTANTEN
44
433.1
OEFFNUNG
DER
BAKTERIELLEN
ZELLEN
MITTELS
OSMOTISCHEM
SCHOCK
44
4332
ANREICHERUNG
DES
ANNEXIN
V
DURCH
REVERSIBLE
BINDUNG
AN
LIPOSOMEN
45
4333
REINIGUNG
DES
ANNEXIN
V
DURCH
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
46
4.4.
KRISTALLOGRAPHISCHE
ARBEITEN
47
4.4.1.
PROTEINKRISTALLISATION
47
4.4.2.
DATENSAMMLUNG
UND
AUSWERTUNG
48
4.4.3.
STRUKTURLOESUNG,
MODELLBAU
UND
VERFEINERUNG
48
III
5.
ERGEBNISSE
50
5.1.
DIE
REINIGUNG
DER
ANNEXIN
V
MUTANTEN
50
5.2.
DIE
N-TERMINAL
DELETIERTE
MUTANTE
51
5.2.1.
HERSTELLUNG
DER
N-TERMINAL
DELETIERTEN
MUTANTE
MIT
HILFE
VON
PCR
52
5.2.2.
DIE
KRISTALLISATION
DER
N-TERMINAL
DELETIERTEN
MUTANTE
54
5.3.
DIE
MUTATIONEN
E17G,
E78Q
UND
E17G/E78Q
AN
DER
PROTEINOBERFLAECHE
55
5.3.1.
KONSTRUKTION
DER
MUTANTE
E78Q
56
5.3.2.
KRISTALLISATION
DER
MUTANTEN
UND
DEREN
STRUKTUR
57
5.4.
DIE
MUTATIONEN
IM
VERMUTLICHEN
KANALBEREICH
61
5.4.1.
HERSTELLUNG
DER
MUTANTEN
E95S,
EL
12G,
E121D
UND
E121S
62
5.4.2.
KRISTALLISATION
DER
MUTANTEN
UND
ERGEBNISSE
DER
DATENSAMMLUNG
63
5.4.3.
STRUKTURLOESUNG
DER
MUTANTEN
E95S
UND
E78Q
64
5.4.4.
VERFEINERUNG
DER
MUTANTEN
E95S
UND
E78Q
65
5.4.5.
DIE
STRUKTUR
DER
MUTANTEN
E95S
UND
DER
MUTANTE
E78Q
66
5.5.
WEITERE
MUTATIONEN
70
5.6.
ERGEBNISSE
DER
ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN
UND
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
70
,
5.6.1.
ERGEBNISSE
DER
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
71
5.6.2.
ERGEBNISSE
DER
ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
71
6.
DISKUSSION
73
6.1.
DIE
REINIGUNG
DER
MUTANTEN
VON
ANNEXIN
V
73
6.2.
DIE
HYDROPHILE
PORE
DES
ANNEXIN
V
IST
DER
LONENLEITWEG
74
6.3.
DISKUSSION
DER
ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
MUTANTE
E95S
AUF
EINER
STRUKTURELLEN
BASIS
76
6.4.
DIE
MUTANTEN
AN
DER
OBERFLAECHE
GEBEN
HINWEISE
AUF
DIE
LAGE
DES
SPANNUNGSSENSORS
79
6.5.
DIE
INAKTIVITAET
DER
N-TERMINAL
DELETIERTEN
MUTANTE
82
6.6.
DIE
NEUE
CALCIUMBINDUNGSSTELLE
IN
DOMAENE
III
83
6.7.
DIE
ROLLE
DER
MEMBRAN
BEI
DER
CALCIUMKANALAKTIVITAET
VON
ANNEXIN
V
UND
BEI
DER
YYINTERPRETATION
DER
DATEN
DER
ANNEXIN
V
MUTANTEN
85
6.8.
ZUSAMMENFASSENDE
INTERPRETATION
DER
DATEN UND
AUSBLICK
85
7.
LITERATURVERZEICHNIS
88
8.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
104 |
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