Molekulare Analyse von HIV-1 in einer chronisch infizierten Gliazellinie: ein Beitrag zum Verständnis von Viruslatenz
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
DER
LEBENSZYKLUS
DES
HUMANEN
IMMUNDEFIZIENZVIRUS
TYP
1
(HIV-1)
1
1.1.1.
KLASSIFIZIERUNG
1
1.1.2.
DAS
VIRUSPARTIKEL
2
1.1.3.
DAS
VIRALE
GENOM
4
1.1.3.1.
TRANSKRIPTION
4
1.1.3.2.
DIE
STRUKTUR-ASSOZIIERTEN
PROTEINE
GAG,
POL
UND
ENV
8
1.1.3.3.
DIE
REGULATION
DER
VIRUSEXPRESSION
9
1.1.3.4.
FUNKTIONEN
DES
PROTEINS
REV
(
"
REGULATOR
OF
VIRION
PROTEIN
EXPRESSION
"
)
12
1.1.4.
VIRUSLATENZ
13
1.2.
HIV-LNFEKTION
DES
ZENTRALEN
NERVENSYSTEMS
15
1.2.1.
KLINISCHE
MANIFESTATIONEN
15
1.2.2.
ZIELZELLEN
IM
GEHIRN
16
1.2.3.
MODELLSYSTEME
FUER
ZNS-INFEKTION
16
1.3.
ZIELSETZUNGEN
DER
ARBEIT
17
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
20
2.1.
ABKUERZUNGS-UND
WORTERKLAERUNGEN
20
2.2.
CHEMIKALIEN
UND
REAGENTIEN
22
2.2.1.
CHEMIKALIEN
UND
GEBRAUCHSWAREN
22
2.2.2.
LOESUNGEN
23
2.2.3.
ANTIKOERPER
25
2.2.4.
PLASMIDE
25
2.3.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
30
2.3.1.
DNS-ISOLATION
AUS
ZELLKULTURMATERIAL
30
2.3.2.
PLASMID-DNS-ISOLATION
AUS
E.COLI
31
2.3.2.1.
GROSSPRAEPARATION
(
"
MAXI
PREP
"
)
31
2.3.2.1.1.
QIAGEN-SAEULEN
31
2.3.2.1.2.
CSCI-DICHTEGRADIENTEN-ULTRAZENTRIFUGATION
31
2.3.2.2.
PLASMIDKLEINPRAEPARATION
(
"
MINI
PREP
"
)
31
2.3.3.
KLONIERUNGSTECHNIKEN
32
2.3.3.1.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
NACH
HANAHAN
32
2.3.3.2.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
DURCH
ELEKTROPORATION
32
2.3.3.3.
DNS
ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
33
2.3.3.4.
LIGATIONEN
33
2.3.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNS
33
2.3.4.1.
NICK-TRANSLATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
33
2.3.4.2.
5
'
-ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
T4-POLYNUKLEOTID-KINASE
34
2.3.5.
"
SOUTHERN
BLOT"
ANALYSE
34
2.3.6.
HYBRIDISIERUNG
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN
/
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
34
2.3.7.
NICHTRADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMIDEN
UND
PCR-PRODUKTEN
35
2.3.8.
VERARBEITUNG
DER
SEQUENZINFORMATION
36
2.3.9.
RNS-ISOLATION
AUS
ZELLKULTURMATERIAL
37
2.3.9.1.
GUANIDINIUMISOTHIOCYANAT-CSCI-TECHNIK
38
2.3.9.2.
RNAZOL-METHODE
(NACH
CHOMCZYNSKI
UND
SACCHI)
38
2.3.9.3.
ISOLIERUNG
VON
"
POLY(A)+
MRNS
"
38
2.3.10.
"
NORTHERNBLOF
'
-ANALYSE
39
2.3.11.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(
"
PCR"
)
39
2.3.11.1.
ALLGEMEINE
REGELN
39
2.3.11.2.
PRIMERAUSWAHL
UND-SYNTHESE
40
2.3.11.3.
OPTIMIERUNGSPARAMETER
40
2.3.11.4.
DNS-PCR
41
2.3.11.5.
PCR
DIREKT
VON
ZELLEN
OHNE
DNS-ISOLATION
42
2.3.11.6.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
42
2.3.12.
REVERSE
TRANSKRIPTIONS-PCR
(
"
RT-PCR
"
)
42
2.3.12.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
43
2.3.12.2.
"
NATIVE
"
RT-PCR
44
2.3.12.3.
QUANTITATIVE
RT-PCR-ANALYSE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
44
2.4.
PROTEINTECHNIKEN
46
2.4.1.
IMMUNPRAEZIPITATION
46
2.4.3.
PROTEINEXTRAKTION
AUS
ZELLEN
47
2.4.4.
HIV-1-P24-ANTIGEN-CAPTURE-ELISA
47
2.4.5.
PROTEINTEST
47
2.5.
ZELLKULTUR
48
2.5.1.
VERWENDETE
ZELLINIEN
48
2.5.2.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
IN
DER
ZELLKULTUR
48
2.5.3.
IMMUNFLUORESZENZ
AN
FIXIERTEN
ZELLEN
49
2.5.4.
TRANSFEKTION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
MIT
GEREINIGTER
PLASMID
DNS
50
2.5.5.
ZELL/ZELL-FUSIONEN
51
2.6.
COMPUTERPROGRAMME
UND
SEQUENZDATENVERARBEITUNG
52
2.6.1.
DIGITAL
EQUIPMENT
(DEC-VAX)-PROGRAMME
52
2.6.2.
UPGMA-VERWANDTSCHAFTSANALYSE
52
2.6.3.
MACINTOSH-PROGRAMME
54
2.7.
LISTE
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKIEOTIDE
54
3.
ERGEBNISSE
57
3.1
SOUTHERNBLOT-ANALYSE:
NUR
EINE
PROVIRUSKOPIE
IN
DAS
GENOM
INTEGRIERT
57
3.2
KLONIERUNG
DES
PROVIRUS
61
3.2.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
NEF-GENS
62
3.2.2.
KLONIERUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
PROVIRALEN
SEQUENZ
65
3.3
SEQUENZANALYSE
69
3.3.1.
SEQUENZIERUNG
69
3.3.2.
DUPLIKATION
VON
41
BP
IN
DER
LTR
76
3.3.3.
VERGLEICH
DER
POTENTIELLEN
SPLEISSSTELLEN
77
3.3.4.
STARTKODONS
FUER
DIE
TRANSLATION
79
3.3.5.
TAT
UND
REV-VERGLEICH
79
3.3.6.
VERGLEICH
DES
"
REV
RESPONSIVE
ELEMENT
"
(RRE)
UND
DER
TAR
REGION
80
3.3.7.
MYRISTYLIERUNGSSTELLE
IM
NEF-GEN
MUTIERT
80
3.3.8.
STOP-KODON
IM
VPR-GEN
80
3.3.9.
DAS
ENV-GEN:
FUENF
AMINOSAEURENAUSTAUSCHE,
DIE
NUR
BEI
TH4-7-5
VORKOMMEN
81
3.3.10.
GAG,
POL,
VIF,
VPU
82
3.3.11.
VERWANDTSCHAFTSBEZIEHUNG
DES
TH4-7-5-PROVIRUS
ZU
ANDEREN
MIT
HIV-1
MB
VERWANDTEN
PROVIREN
83
3.4
NORTHERNBLOT-ANALYSE:
NUR
SCHWACHE
EXPRESSION
DER
REV-ABHAENGIGEN
TRANSKRIPTE
IN
TH4-7-5
85
3.5
TRANSKRIPTANALYSE
MIT
HILFE
DER
RT-PCR
90
3.5.1.
RT-PCR:
FEINANALYSE
DER
HIV-TRANSKRIPTE
IN
TH4-7-5
92
3.5.2.
KLASSE
3:
DIE
MEHRFACH
GESPLEISSTEN
KLEINEN
TRANSKRIPTE
92
3.5.3.
VERGLEICH
ALLER
DREI
KLASSEN,
UNGESPLEISST,
EINFACH
UND
MEHRFACH
GESPLEISST:
PRODUKTIVE
VERSUS
NICHT-PRODUKTIVE
INFEKTION
99
3.5.4.
EXON
6D
ENTHALTENDE
TRANSKRIPTE
100
3.6
REV-IMMUNOPRAEZIPITATION:
PRODUKTION
VON
REV-PROTEIN
102
3.7
FUNKTIONELLE
STUDIEN
103
3.7.1.
ZELL/ZELL
FUSION
103
3.7.2.
TRANSFEKTION
MIT
REV
UND
GAG-PLASMIDEN
109
3.7.2.1.
TRANSFEKTION
MIT
REV-PLAMIDEN
109
3.7.2.2.
WT-GAG-PLASMIDE
110
3.7.2.3.
GAG-PLASMIDE
OHNE
RNS-INSTABILITAETSELEMENTE
110
3.8
IMMUNOFLUORESZENZ:
NUKLEOLAERE
REV-LOKALISATION
IST
GESTOERT
111
3.9
SEQUENZIERUNG
VON
REV/RRE
AUS
RC2A/TH
ZELLEN
117
4.
DISKUSSION
120
4.1
SEQUENZANALYSE
DES
TH4-7-5-PROVIRUS:
EIN
FUNKTIONSFAEHIGES
INTEGRAT
120
4.1.1.
KLONIERUNG
VON
HIV-1
:
DIREKTE
PCR-AMPLIFIKATION
PROVIRALER
SEQUENZABSCHNITTE
ALS
ALTERNATIVE
ZUR
ISOLATION
DES
PROVIRUS
AUS
EINER
X-GENBANK
120
4.1.2.
SEQUENZANALYSE
121
4.1.2.1.
VORTEILE
DER
NICHTRADIOAKTIVEN
METHODE
121
4.1.2.2.
DUPLIKATION
IN
DER
LTR
122
4.1.2.3.
VERAENDERUNGEN
IN
ENV.
HINWEISE
FUER
T-ZELL-TROPISMUS
DES
TH4-7-5-VIRUS
124
4.1.2.4.
STOP-KODON
IN
VPR.
MOEGLICHE
AUSWIRKUNGEN
AUF
MAKROPHAGENTROPISMUS
125
4.1.2.5.
VERWANDTSCHAFTSANALYSE
127
4.1.2.6.
NEF
NICHT
MYRISTYLIERT:
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
LOKALISATION
127
4.1.3.
DAS
TH4-7-5-PROVIRUS
IST
FUNKTIONELL
128
4.2.
ANALYSE
DER
RNS-EXPRESSION
VON
HIV
IN
DEN
GLIAZELLEN
128
4.2.1.
NORTHERNBLOT-ANALYSE:
PHAENOTYP
EINES
REV-DEFEKTEN
PROVIRUS
128
4.2.2.
ENTWICKLUNG
EINER
QUANTITATIVEN
RT-PCR
ERMOEGLICHT
DIE
FEINANALYSE
VON
HIV-TRANSKRIPTEN
129
4.3
FUNKTIONSANALYSE
VON
REV
IN
DEN
GLIAZELLEN:
EIN
DOMINANTER,
POSTTRANSLATIONELLER
BLOCK
DER
REV-FUNKTION
131
4.3.1.
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
VON
REV
131
4.3.2.
FUSIONSEXPERIMENTE
132
4.3.3.
NUR
SEHR
SCHWACHE
TRANSAKTIVIERUNG
RRE
ENTHALTENDER
TRANSKRIPTE
DURCH
REV
133
4.3.4.
INAKTIVIERUNG
VON
INS-ELEMENTEN
IN
GLIAZELLEN
IST
INEFFEKTIV
133
4.3.5.
REV:
BETEILIGUNG
ZELLULAERER
FAKTOREN
AN
DER
REV-FUNKTION
134
4.3.6.
"
VIRUSRESCUE
"
IN
RC-2A
137
4.4
LATENZ
UND
ZNS:
TH4-7-5
ALS
MODELLSYSTEM
137
5.
ZUSAMMENFASSUNG
140
6.
LITERATURVERZEICHNIS
141
7.
PUBLIKATIONEN
150 |
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