Vasoaktives intestinales Polypeptid: Einfluss auf die Insulinsekretion, Ionenfluxe und Second messenger Systeme von Langerhans Inseln der Maus
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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INHALTSVERZEICHNIS
I
1
EINLEITUNG
1.1
MECHANISMUS
DER
INSULINSEKRETION
1
1.1.1
DIE
B-ZELLE
1
1.1.2
STIMULUS-SEKRETIONSKASKADE
1
1.2
LONENKANAELE
4
1.2.1
K'-KANAELE
4
1.2.1.1
ATP-SENSITIVER
K'-KANAL
4
1.2.1.2
ANDERE
K'
-KANAELE
6
1.2.2
NA'-KANAL
7
1.2.3
CA"-KANAELE
8
1.3
DIE
ELEKTRISCHE
AKTIVITAET
DER
B-ZELLE
11
1.4
BEDEUTUNG
VON
INTRAZELLULAEREM
CA"
FUER
DIE
INSULINSEKRETION
13
1.4.1
CA"-INFLUX
13
1.4.2
CA"-EFFLUX
14
1.4.2.1
DUALER
EFFEKT
DER
GLUCOSE
AUF
DEN
"CA"-EFFLUX
16
1.4.3
INTRAZELLULAERE
CALCIUMSPEICHER
18
1.4.4
CALCIUMBINDENDE
PROTEINE
19
1.4.5
CYTOSOLISCHES
CALCIUM
19
1.5
DAS
ADENYLATCYCLASESYSTEM
21
1.5.1
AUFBAU
DES
ADENYLATCYCLASESYSTEMS
21
1.5.2
AKTIVIERUNG
DER
ADENYLATCYCLASE
22
1.5.3
PROTEINKINASE
A
23
1.6
BEDEUTUNG
DES
PHOSPHOLIPIDSTOFFWECHSELS
24
1.6.1
INOSITOL-L,4,5-TRISPHOSPHAT
ALS
SECOND
MESSENGER
24
1.6.2
REZEPTORVERMITTELTE
STIMULATION
DER
PHOSPHOLIPASE
C
25
1.6.3
BEEINFLUSSUNG
DER
PHOSPHOLIPASE
C-AKTIVITAET
DURCH
INITIATOREN
DER
INSULINSEKRETION
25
1.6.4
DIACYLGLYCEROL
27
1.6.5
PROTEINKINASE
C
28
1.7
MODULATION
DER
INSULINSEKRETION
DURCH
PEPTIDE
30
1.7.1
NEUROPEPTIDERGE
REGULATION
DER
INSULIN
SEKRETION
30
1.7.2
NEUROPEPTIDE
MIT
INHIBITORISCHER
WIRKUNG
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
31
1.7.2.1
GALANIN
31
1.7.2.2
CALCITONIN
GENE-RELATED
PEPTIDE
32
II
INHALTSVERZEICHNIS
1.7.2.3
NEUROPEPTID
Y
32
1.7.3
NEUROPEPTIDE
MIT
STIMULATORISCHER
WIRKUNG
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
33
1.7.3.1
GASTRIN
RELEASING
PEPTIDE
33
1.7.3.2
CHOLECYSTOKININ
33
1.7.3.3
PITUITARY
ADENYLATE-CYCLASE
ACTIVATING
POLYPEPTIDE
34
1.7.3.4
VASOAKTIVES
INTESTINALES
POLYPEPTID
34
1.8
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
40
2
MATERIAL
42
2.1
VERSUCHSTIERE
42
2.2
GERAETE
42
2.3
CHEMIKALIEN
43
2.4
ELEKTROLYTLOESUNGEN
45
2.4.1
MODIFIZIERTE
KREBS-RINGER-BICARBONAT
LOESUNG
45
2.4.2
KREBS-RINGER-BICARBONAT-LOESUNG
OHNE
CALCIUM
46
2.4.3
KREBS-RINGER-BICARBONAT-LOESUNG
OHNE
NATRIUM
46
2.4.4
KREBS-RINGER-HEPES-LOESUNG
46
2.4.5
PUFFER
FUER
DEN
LINCO
INSULIN
RADIOIMMUNOASSAY
47
2.4.6
MEERSCHWEINCHEN-ANTIKOERPER
GEGEN
RATTENINSULIN
47
2.4.7
PUFFER
FUER
DIE
RATTENINSULINSTANDARDLOESUNG
47
2.4.8
L,,
J-INSULIN
48
2.4.9
FAELLUNGSLOESUNGEN
ZUR
FAELLUNG
DES
INSULIN-ANTIKOERPER-KOMPLEXES
48
2.4.9.1
PHOSPHATPUFFER
FUER
DAS
FAELLUNGSGEMISCH
48
2.4.9.2
KOHLELOESUNG
NORIT
A
48
2.4.9.3
DEXTRANLOESUNG
48
2.4.9.4
FAELLUNGSLOEUNGEN
FUER
DEN
LINCO
RADIOIMMUNOASSAY
49
2.5
LOESUNGEN
ZUR
BESTIIMUNG
DES
CYCLISCHEN
AMP
49
2.5.1
NATRIUMACETATPUFFER
49
2.5.2
ACETYLIERUNGSGEMISCH
49
2.5.3
FORSKOLIN
49
2.6
LOESUNGEN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
INOSITOL-(1,4,5)
TRISPHOSPHAT
50
2.6.1
PERCHLORSAEURE
50
2.6.2
KOH/HEPES-LOESUNG
ZUR
NEUTRALISATION
50
2.6.3
ASSAY
PUFFER
50
2.6.4
TRACER
50
2.6.5
STANDARD
50
2.6.6
BINDUNGSPROTEIN
51
2.7
STAMMLOESUNGEN
51
2.7.1
VIP-STAMMLOESUNG
51
2.7.2
GRP-STAMMLOESUNG
51
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.8
MEDIEN
51
2.8.1
MEDIUM
FUER
DIE
PRAEPARATION
DER
INSELN
51
2.8.2
MEDIEN
FUER
DIE
PERIFUSIONSVERSUCHE
52
2.8.2.1
BELADUNGSMEDIUM
FUER
DIE
PERIFUSIONSVERSUCHE
52
2.8.2.2
MEDIUM
FUER
DIE
PERIFUSIONSVERSUCHE
52
2.8.3
MEDIUM
FUER
DIE
HAUPTINKUBATION
BEI
DER
"CA
"
-AUFNAHME
52
2.8.4
SONSTIGE
HAUPTINKUBATIONSMEDIEN
53
3
METHODEN
54
3.1
ISOLIERUNG
DER
LANGERHANS
INSELN
54
3.1.1
PRAEPARATION
DES
PANKREAS
54
3.1.2
ISOLIERUNG
DER
LANGERHANS
INSELN
54
3.2
PERIFUSIONSVERSUCHE
55
3.2.1
PERIFUSIONSAPPARATUR
55
3.2.2
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
ZUR
MESSUNG
DES
"RB'-EFF
LUXES
57
3.2.2.1
HAUPTINKUBATION
57
3.2.2.2
WASCHVORGANG
57
3.2.2.3
PERIFUSION
DER
INSELN
60
3.2.2.4
REINIGUNG
DER
APPARATUR
61
3.2.2.5
"RUBIDIUM
UND
SEINE
BESTIMMUNG
IM
BETA-COUNTER
61
3.2.2.6
BERECHNUNG
DER
EFFLUXRATE
62
3.2.3
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
ZUR
BESTIMMUNG
DES
"CA"-EFFLUXES
62
3.2.3.1
HAUPTINKUBATION
62
3.2.3.2
PERIFUSION
63
3.2.3.3
PERIFUSION
UNTER
CALCIUMFREIEN
BEDINGUNGEN
63
3.2.3.4
PERIFUSION
UNTER
NATRIUMFREIEN
BEDINGUNGEN
63
3.2.3.5
SIMULTANBESTIMMUNG
64
3.2.3.6
"CALCIUM
UND
SEINE
BESTIMMUNG
IM
SS-COUNTER
64
3.3
METHODE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
"CA"-AUFNAEHME
65
3.3.1
SILIKONOELTRENNMETHODE
65
3.3.2
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
65
3.3.2.1
VORBEREITUNG
DER
REAKTIONSGEFAESSE
65
3.3.2.2
EINBRINGEN
DER
INSELN
IN
DIE
PROBENROEHRCHEN
66
3.3.2.3
HAUPTINKUBATION
66
3.3.2.4
VORBEREITEN
DER
PROBEN
ZUR
MESSUNG
66
3.3.2.5
AUSWERTUNG
DER
MEBERGEBNISSE
67
3.4
VERSUCHE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
INSULINSEKRETION
69
3.4.1
INKUBATION
VON
LANGERHANS
INSELN
69
3.4.2
RADIOIMMUNOLOGISCHE
BESTIMMUNG
VON
INSULIN
69
3.4.2.1
MODIFIKATION
DER
INSULINBESTIMMUNG
70
3.5
METHODE
ZUR
BESTIMMUNG
DES
CYCLISCHEN
AMP
71
3.5.1
INKUBATION
VON
LANGERHANS
INSELN
ZUR
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5
5.4
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
"CA"-AUFNAHME
IN
BESTIMMUNG
DES
CAMP
71
3.5.2
GEWEBEFIXIERUNG
71
3.5.3
AUFSCHLUSS
DES
INSELGEWEBES
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
72
3.5.4
CAMP-EXTRAKTION
AUS
DENATURIERTEM
INSELGEWEBE
72
3.5.5
EXTRAKTION
VON
TCA
MIT
ETHER
72
3.5.6
RADIOIMMUNOLOGISCHE
BESTIMMUNG
VON
CAHP
73
3.5.7
PRINZIP
DES
RIA
73
3.5.8
DURCHFUEHRUNG
DES
RADIOIMMUNOASSAY
73
3.5.8.1
EICHKURVE
73
3.5.8.2
AUFBEREITUNG
DER
PROBEN
74
3.5.9
VERSUCHSAUSWERTUNG
74
3.6
BESTIMMUNG
VON
INOSITOLPHOSPHAT
75
3.6.1
GEWINNUNG
DER
PROBEN
75
3.6.2
D-MYO-INOSITOL
(1,4,5)
-TRISPHOSPHAT
['HJASSAY
SYSTEM
76
3.6.2.1
PRINZIP
DES
BINDUNGSASSAYS
76
3.6.2.2
DURCHFUEHRUNG
DES
BINDUNGSASSAYS
77
3.6.3
AUSWERTUNG
DER
PROBEN
77
3.7
STATISTIK
77
METHODISCHE
ERGEBNISSE
79
4.1
TESTUNG
DER
PERIFUSIONSAPPARATUR
79
4.2
UEBERPRUEFUNG
DES
PERIFUSIONSSCHEMA
FUER
DIE
MESSUNG
DES
"
CA"-EFFLUXES
82
VERSUCHSERGEBNISSE
86
5.1
WIRKUNG
VON
VIP
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
86
5.1.1
VIP:
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVE
87
5.1.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
GLUCOSEKONZENTRATIONEN
90
5.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"RB'-EFFLUX
93
5.2.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"RB'-EFFLUX
BEI
3
MM
GLUCOSE
93
5.2.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"RB'-EFFLUX
BEI
5,6
MM
GLUCOSE
96
5.2.3
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"RB'-EFFLUX
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
GLUCOSEKONZENTRATIONEN
96
5.3
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
"CA
'
'-AUFNAHME
101
5.3.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGSBEZIEHUNG
101
5.3.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
"CA"-AUFNAHME
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
GLUCOSEKONZENTRATIONEN
102
INHALTSVERZEICHNIS
V
GEGENWART
VON
CALCIUMANTAGONISTEN
107
5.4.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
,,
CA"-AUFNAHME
IN
GEGENWART
VON
ISRADIPIN
UND
COBALT
107
5.4.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
'
'CA**-AUFNAHME
IN
GEGENWART
VON
2,5
MH
COBALT
108
5.4.3
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
"
CA"-AUFNAHME
IN
GEGENWART
VON
FLUNARIZIN
113
5.5
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
"CA"-AUFNAHME
IN
GEGENWART
VON
TETRODOTOXIN
116
5.6
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
IN
GEGENWART
VON
CALCIUMANTAGONISTEN
119
5.6.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
IN
GEGENWART
VON
VERSCHIEDENEN
COBALTKONZENTRATIONEN
119
5.6.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
INSULINSEKRETION
IN
GEGENWART
VON
ISRADIPIN
UND
FLUNARIZIN
122
5.7
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
,,
CA
,,
-EFF
LUX
125
5.7.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"CA"-EFFLUX
BEI
GLUCOSEKONZENTRATIONEN
VON
11,1
UND
16,7
MH
125
5.7.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
GLUCOSEINDUZIERTE
STEIGERUNGS
DES
"CA"-EFFLUXES
125
5.7.3
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
I
CA"-EFFLUX
BEI
KONSTANTER
GLUCOSEKONZENTRATION
131
5.7.4
VERGLEICH
DER
WIRKUNG
VON
VIP
UND
GRP
131
5.7.5
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"CA
!
'-EFFLUX
IN
ABWESENHEIT
VON
EXTRAZELLULAEREM
CALCIUM
139
5.7.6
EINFLUSS
VON
GRP
UND
VIP
AUF
DEN
"CA'*-EFFLUX
IN
ABWESENHEIT
VON
EXTRAZELLULAEREM
CALCIUM
144
5.7.7
SIMULTANBESTIMMUNG
144
5.7.8
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
4,
CA'
'
-EFFLUX
NACH
BLOCKADE
DES
NA'/K'-AUSTAUSCHERS
150
5.7.8.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
,,
CA"-EFFLUX
IN
GEGENWART
VON
CHOLIN
IN
CALCIUMFREIEM
MEDIUM
150
5.7.8.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"
CA*'-EFFLUX
IN
GEGENWART
VON
CHOLIN
IN
CALCIUMHALTIGEM
MEDIUM
155
5.7.9
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"CA"-EFFLUX
IN
GEGENWART
VON
OUABAIN
156
5.7.10
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
"
CA"-EFFLUX
IN
GEGENWART
VON
CHARYBDOTOXIN
159
5.7.11
MESSUNG
DES
"CA"-EFFLUXES
BEI
ZUSATZ
VON
VIP
WAEHREND
DER
HAUPTINKUBATION
162
5.7.11.1
EINFLUSS
VON
CARBACHOL
AUF
DEN
"CA"EFFLUX
BEI
ZUSATZ
VON
VIP
WAEHREND
DER
HAUPTINKUBATION
162
5.7.11.2
EINFLUSS
VON
CARBACHOL
AUF
DEN
"CA"-EFFLUX
IN
GEGENWART
VON
VIP
UND
COBALT
WAEHREND
DER
HAUPTINKUBATION
164
5.8
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
ADENYLATCYCLASE
169
VI
INHALTSVERZEICHNIS
5.8.1
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
CAHP-GEHALT
IN
LANGERHANS
INSELN
DER
HAUS
169
5.8.2
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DEN
CAMP-GEHALT
IN
LANGERHANS
INSELN DER
RATTE
172
5.9
EINFLUSS
VON
VIP
AUF
DIE
BILDUNG
VON
IP,
175
6
DISKUSSION
178
6.1
INSULINSEKRETION
179
6.1.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVE
179
6.1.2
GLUCOSEABHAENGIGKEIT
DES
VIP-EFFEKTS
180
6.2
LONENFLUXE
181
6.2.1
K'-LEITFAEHIGKEIT
181
6.2.2
"CA"-AUFNAHME
183
6.2.2.1
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-KURVE
183
6.2.2.2
GLUCOSEABHAENGIGKEIT
184
6.2.3
EINFLUSS
VON
CA"
UND
NA'-KANALANTAGONISTEN
AUF
DIE
"CA"-AUFNAHME
UND
DIE
INSULINSEKRETION
186
6.2.4
CA"-EFFLUX
193
6.2.4.1
CA"-EFFLUXSTUDIEN
IN
CALCIUMFREIEM
HILIEU
194
6.2.4.2
SIMULTANBESTIMMUNG
195
6.2.4.3
INTERAKTION
VON
VIP
MIT
AKTIVEN
CA"
EXTRUSIONSMECHANISMEN
196
6.2.4.4
VIP
UND
INTRAZELLULAERE
CA"-SPEICHER
199
6.2.4.5
CA"-EFFLUX
UND
CHARYBDOTOXIN
202
6.3
ADENYLATCYCLASEAKTIVITAET
203
6.4
INOSITOL-(L,4,5)-TRISPHOSPHAT
205
7
ZUSAMMENFASSUNG
206
7.1
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
206
7.2
ERGEBNISSE
207
7.3
SCHLUSSFOLGERUNG
209
8
LITERATURVERZEICHNIS
210 |
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