Immunologische und molekularbiologische Untersuchung des Hüllproteins vom Milden Gerstenmosaikvirus (BaMMV):
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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1993
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I.
INHALTSVERZEICHNIS
I.
INHALTSVERZEICHNIS
II
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1
VIRUSKRANKHEITEN
DER
PFLANZE
1
12
DIE
KLASSE
DER
POTYVIREN
1
1.3
DAS
MILDE
GERSTENMOSAIKVIRUS
(BARLEY
MILD
MOSAIC
VIRUS,
BAMMV)
4
1.4
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
UND
IHRE
EINSATZMOEGLICHKEITEN
IN
DER
PFLANZENVIRO
LOGIE
6
1.5
AUFGABENSTELLUNG
8
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
11
2.1
MATERIAL
1T
2.1.1
CHEMIKALIEN,
MEDIEN
UND
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
11
2.12
BEZUGSQUELLENVERZEICHNIS
AUSGEWAEHLTER
CHEMIKALIEN
11
2.1.3
MEDIEN
12
2.1.4
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER:
12
2.1.5
VIRUSINFIZIERTES
PFLANZENMATERIAL
UND
WIRTSPFLANZEN
12
2.1.6
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
UND
POLYKLONALE
SEREN
13
2.1.7
VERSUCHSTIERE
13
2.1.8
ZELLINIEN
13
2.19
BAKTERIENSTAEMME
14
2.1.10
PLASMIDE
14
2.1.11
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
15
22
VIROLOGISCHE
METHODEN
15
2.2.1
PFLANZENANZUCHT
15
222
INOKULATION
DER
GERSTE
MIT
BAMMV
15
22.3
VIRUSISOLATION
16
2.2.4
SANDWICH-E
LISA
ZUM
NACHWEIS
VON
BAMMV
IM
ROHEXTRAKT
MIT
POLY
KLONALEN
SEREN
17
2.3
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
18
2.3.1
IMMUNISIERUNG
VON
BALB/C
MAEUSEN
18
2.3.2
BESTIMMUNG
DES
ANTIKOERPERTITERS
19
2.3.3
ARBEITEN
MIT
HYBRIDOMA-KULTUREN
20
2.3.3.1
ZELLFUSIONEN
20
2.3.32
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
MYELOM
UND
HYBRIDOMAZELLLEN
22
2.S.3.3
KLONIERUNG
UND
SUBKLONIERUNG
VON
HYBRIDOMALINIEN
UEBER
EINE
LIMITIERENDE
VERDUENNUNG
22
2.3.3.4
HYBRIDOMAGROSSKULTUR
22
2.3.4
E
LISA
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
GEEIGNETER
HYBRIDOMAKLONE
23
2.3.5
NACHWEIS
VON
BAMMV
IM
WESTERN
BLOT
23
2.3.6
AUFREINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
AUS
DEM
KULTURUEBERSTAND
24
2.4
MIKROSKOPISCHE
METHODEN
25
2.4.1
NEGATIVFAERBUNG
VON
VIRUSISOLATEN
25
2.4.2
DEKORATIONSTEST
MIT
GOLD
MARKIERTEN
ANTIKOERPERN
25
2.4.3
FIXIERUNG,
DEHYDRIERUNG
UND
E
INBETTUNG
VERSCHIEDENER
GERSTENGE
WEBE
IN
LOWICRYL
K4M
26
2.4.4
MIKROTOMIE
27
2.4.5
IMMUNOGOLDMARKIERUNG
VON
ULTRADUENNSCHNITTEN
DER
GERSTE
27
2.4.6
NACHKONTRASTIERUNG
DER
ULTRADUENNSCHNITTE
28
2.4.7
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
28
2.5
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
28
2.5.1
AMINOTERMINALE
PROTEINANSEQUENZIERUNG
28
2.5.2
PROTEINBESTIMMUNGEN
29
2.5.3
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
29
2.5.4
3
'
MARKIERUNG
VON
DNA-OLIGONUKLEOTIDEN
MIT
DIGOXIGENIN-DUTP
29
2.5.5
UEBERPRUEFUNG
DER
DIGOXYGENIN-MARKIERUNG
30
2.5.6
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXYGENIN-MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
31
2.5.7
POLYMERASE
KETTEN
REAKTION
(PCR)
MIT
DEGENERIERTEN
OLIGONUKLEO
TIDEN
32
2.5.8
RESTRIKTION
VON
DNA
32
2.5.9
GELELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
GELASE
33
2.5.10
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARISIERTER
DNA
33
2.5.11
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
33
2.5.12
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
-
ZELLEN
33
2.5.13
PIASMIDMINIPRAEPARATION
34
2.5.14
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFREINIGUNG
VON
PLASMIDEN
IM
GROSSEN
MASSSTAB34
2.5.15
GESAMT-RNA-E
XTRAKTION
AUS
GERSTENBLAETTERN
35
2.5.16
POLY
A*"
RNA
ANREICHERUNG
UEBER
OLIGO
DT-ZELLULOSE-SAEULEN
CHROMATOGRAPHIE
36
2.5.17
CDNA-HERSTELLUNG
37
2.6
EXPERIMENTE
MIT
REKOMBINANTEN
HUELLPROTEINEN
UND
IHREN
DERIVATEN
37
2.6.1
INDUKTION
VON
EXPRESSIONSKLONEN
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
37
2.62
INDUKTIONSEXPERIMENTE
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
37
2.6.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
AUFREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
MIT
N-TERMINALEM
HISTIDIN-OLIGOMER
38
2.6.4
AUFKONZENTRIERUNG
DER
PROTEINFRAKTIONEN
MIT
ZENTRIKON-ROEHRCHEN
39
2.6.5
MIKRODIALYSE
40
2.6.6
ANALYSE
DER
ZELLULAEREN
LOKALISIERUNG
REKOMBIANTER
HUELLPROTEINE
40
2.7
GELELEKTROPHORESEN
UND
FAERBEMETHODEN
40
2.7.1
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
UNTER
NICHT
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
40
2.72
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
41
2.7.3
PROTEINGELELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
41
2.7.4
SILBERFAERBUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
42
2.7.5
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
NACH
BLUM
42
2.7.6
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
42
3.
ERGEBNISSE
43
3.1
VIRUSISOLATIONEN
43
3.1.1
INOKULATIONSEFFIZIENZ
43
3.12
AUSBEUTE
UND
QUALITAET
DER
VIRUSISOLATE
43
32
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTI-BAMMV
ANTIKOERPER
45
32.1
IMMUNISIERUNGEN
UND
FUSIONEN
45
32.1.1
E
RMITTLUNG
DES
ANTIKOERPERTITERS
45
32.12
FUSIONSEFFIZIENZ
UND
AUSBEUTE
AN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
46
32.1.3
SUBKLASSENZUGEHOERIGKEIT
47
3.3
IMMUNOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
HUELLPROTEINS
47
3.3.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KREUZREAKTIVITAET
VON
ML
MIT
BAYMV
UND
ENDOGENEN
PROTEINEN
47
3.32
E
INSATZ
DES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
M1
ZUR
DIAGNOSE
VON
BAMMV-LNFEKTIONEN
IM
ROHEXTRAKT
INFIZIERTER
PFLANZEN
48
3.3.3
ANALYSE
DER
KREUZREAKTIVITAET
VON
M1
MIT
DEN
JAPANISCHEN
ISOLATEN
BAMMV-KAL
UND
NAL
50
3.3.4
ANALYSE
DES
BAMMV-HUELLPROTEINS
UND
SEINE
'
DEGRADATIONSPRODUKTE
'
IM
WESTERN
BLOT
51
3.3.5
ANALYSE
DER
BINDESTELLE
DES
HUELLPROTEINS
FUER
DEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
ML
53
3.4
LOKALISIERUNG
DES
VIRUSHUELLPROTEINS
IM
PFLANZENGEWEBE
55
3.4.1
IMMUNZYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
BAMMV
IN
CHLOROTISCHEN
UND
JUNGEN
BLATTEILEN
MECHANISCH
INFIZIERTER
GERSTE
MIT
DEM
ELEKTRO
NENMIKROSKOP
55
3.42
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
DETEKTION
VON
BAMMV
IN
WURZELSPITZEN
INFIZIERTER
GERSTE
59
3.5
LOKALISIERUNG
DES
BAMMV-HUELLPROTEINS
AUF
DEM
VIRUSGENOM
61
3.5.1
ERMITTLUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
VIRUSHUELLPROTEINS
61
3.52
COMPUTERGESTUETZTE
HOMOLOGIESUCHE
DER
ERMITTELTEN
AMINOSAEURESE
QUENZ
GEGEN
DIE
SWISSPROT
UND
E
MBL-DATENBANK
62
3.5.3
GROBE
LOKALISIERUNG
DES
N-TERMINUS
DES
HUELLPROTEINS
MIT
DIGOXY
GENIN
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
62
3.5.3.1
ERSTE
UEBERLEGUNGEN
ZUR
AUSWAHL
EINES
GEEIGNETEN
OLIGONU
KLEOTIDS
62
3.5.32
LOKALISIERUNG
DES
N-TERMINUS
DES
HUELLPROTEINGENS
AM
3
'
ENDE
VON
RNA-1
63
3.5.4
IDENTIFIZIERUNG
DES
HUELLPROTEINGENS
DURCH
EXPRESSION
DES
VORSE
LEKTIONIERTEN
RESTRIKTIONSFRAGMENTES
IN
E
.COLI
66
3.5.4.1
KLONIERUNG
EINES
SPH
I/SAL
I-RESTRIKTIONSFRAGMENTES
IN
DIE
EXPRESSIONSVEKTOREN
PQE
30,
-31
UND
-32
66
3.5.42
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
EXPRIMIERTEN
GENPRODUKTES
69
3.5.5
FEINLOKALISIERUNG
DES
HUELLPROTEINS
MIT
HILFE
DER
PCR-TECHNIK
72
3.5.5.1
AMPLIFIZIERUNG
DES
"ISOLIERTEN
"
HUELLPROTEINS
UEBER
PCR
73
3.5.52
SUBKLONIERUNG
DES
PCR-PRODUKTES
IN
PBLUESCRIPT
77
3.5.5.3
KLONIERUNG
DES
"
ISOLIERTEN
"
HUELLPROTEINGENS
IN
DIE
E
XPRESSIONS
VEKTOREN
PQE
30-32
78
3.5.5.4
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
GENEXPRIMIERTEN
HUELLPROTEINS
80
3.5.5.5
L
OKALISIERUNG
DES
HUELLPROTEINS
IN
E
.
COLI
84
3.6
HERSTELLUNG
EINES
AUFGEREINIGTEN
ANTIGENS
AUF
DER
BASIS
EINES
GENEX
EPRIMIERTEN
HUELLPROTEINS
86
3.6.1
AUFREINIGUNG
DER
EXPRIMIERTEN
HUELLPROTEINE
UEBER
EINE
AFFINITAETSCHROMA
TOGRAPHIE
UND
IHR
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
86
3.62
AUFBEREITUNG
DES
AUFGEREINIGTEN
HUELLPROTEINS
ZUR
VERWENDUNG
ALS
ANTIGEN
92
4.
DISKUSSION
94
4.1
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTI-BAMMV
ANTIKOERPER:
METHODISCHE
ASPEKTE94
42
VIRUSNACHWEIS
VON
BAMMV
MIT
EINEM
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
95
42.1
E
INSATZ
MONOKLONALER
ANTI-BAMMV
ANTIKOERPER
IN
DER
VIRUSDIAGNOSTIK
96
4.2.2
ANALYSE
DER
KREUZREAKTIVITAETEN
VON
ML
96
42.3
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
M1
98
4.3
IMMUNZYTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
BAMMV
IM
PFLANZENGEWEBE
100
4.3.1
METHODISCHE
ASPEKTE
100
4.3.2
VERTEILUNG
VON
BAMMV
IN
VERSCHIEDENEN
ORGANEN
UND
GEWEBE
TYPEN
UND
IHRE
MOEGLICHE
BEDEUTUNG
FUER
DIE
VIRUSVERMEHRUNG
101
4.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GENOMISCHEN
ORGANISATION
4.5
AUSBLICK
104
106
5.
ZUSAMMENFASSUNG
109
6.
LITERATURVERZEICHNIS
110 |
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