Funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors KRÜPPEL von Drosophila melanogaster:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
SEIT
1
.
2
.
2.1.
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.1.2.
2.1.1.3.
2.1.1.4.
2.1.1.4.1.
2.1.1.4.2.
2.1.1.4.3
2.1.1.4.3.1.
2.1.1.4.3.2.
2.1.1.4.3.3.
2.1.1.5.
2.1.1.5.1.
2.1.1.5.1.2.
2.1.1.5.1.3.
2.1.1.5.2.
2.1.1.5.3.
2.1.1.5.4.
2.1.1.6.
2.1.1.7.
EINLEITUNG
1
MATERIAL
UND
METHODEN
17
MOLEKULARBIOLOGIE
17
VERSUCHE
MIT
NUKLEINSAEUREN
17
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
17
PRAEPARATION
VON
GROSSEN
PLASMID-DNA-MENGEN
17
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
PLASMID-DNA
18
OLIGONUKLEOTIDE
19
YYCAT-PRIMER"
19
YYSTARTKODON-LINKER"
19
OLIGONUKLEOTIDE
MIT
PROTEINBINDUNGS
SEQUENZEN
20
OLIGONUKLEOTIDE
MIT
KRUEPPEL-BINDUNGSSTELLEN
20
HERSTELLUNG
VON
MULTIMEREN
DER
OLIGO
NUKLEOTIDE
MIT
KRUEPPEL-BINDUNGSSTELLEN
22
OLIGONUKLEOTIDE
MIT
HUNCHBACK-,
GIANT
ODER
KNIRPS-BINDUNGSSTELLEN
22
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
24
PLASMIDE
FUER
DIE
IN
VITRO-TRANSKRIPTION
24
KRUEPPEL-TRANSKRIPTIONSPLASMIDE
25
GAP-GEN-TRANSKRIPTIONSPLASMIDE
25
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONSREAKTION
26
IN
VITRO-TRANKRIPTION
IN
KERNEXTRAKTEN
AUS
HELA
ZELLEN
26
YYPRIMER-EXTENSION"
:
QUANTIFIZIERUNG
DER
CAT-MRNA
AUS
ZELLEXTRAKTEN
27
BAKTERIELLE
EXPRESSIONSVEKTOREN
28
ZELLKULTUR-EXPRESSIONSVEKTOREN
29
2.1.1.7.1
2.1.1.7.2
2.1.1.7.2
2.1.1.7.2
2.1.1.7.2
2.1.1.8.
2.1.1.8.
2.1.1.8.2
2.1.1.8.3
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6.
2.2.7.
2.2.8.
2.2.9.
2.2.9.1.
2.2.9.2.
2.2.9.2.1
2.2.9.2.2
2.10.
2.10.1.
2.10.2.
2.10.3.
.
GAP-GEN-EFFEKTORPLASMIDE
30
.
KRUEPPEL-GAL4-FUSIONSPROTEIN/
EFFEKTORPLASMIDE
31
.1.
GAL4-BASIS-VEKTOREN
31
.2.
GAL4-EFFEKTORPLASMIDE
32
.3.
GAL4/KRUEPPEL-FUSIONSPROTEIN
EFFEKTORPLASMIDE
32
REPORTERPLASMIDE
35
REPORTERPLASMIDE
MIT
KRUEPPEL
BINDUNGSSTELLEN
35
.
REPORTERPLASMIDE
MIT
FRAGMENTEN
DER
CIS-REGULATORISCHEN
REGION
DES
GAP-GENS
KNIRPS
37
.
REPORTERPLASMIDE
MIT
GAL4-BINDUNGSSTELLEN
38
PROTEINTECHNIKEN
39
IMMUNOHISTOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
EFFEKTORGENPRODUKTE
IM
ZELLKERN
39
HERSTELLUNG
VON
KERNPROTEINEXTRAKTEN
40
ELISA
40
PROTEIN-GELELEKTROPHORESE
40
WESTERN-BLOT
41
IN
VITRO-TRANSLATION
41
IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
41
DNA-ABHAENGIGE
PRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
42
CHEMISCHE
QUERVERNETZUNG
VON
PROTEINEN
43
GLUTARALDEHYD-QUERVERNETZUNG BAKTERIELLER
PROTEINE
44
QUERVERNETZUNG
VON
IN
VITRO-TRANSLATIERTEN
PROTEINEN
44
.
GLUTARALDEHYD-QUERVERNETZUNG
44
.
QUERVERNETZUNG
MIT
BISMALEIDOHEXAN
45
"BANDSHIFF'-ANSATZ
45
BANDSHIFT
MIT
IN
VITRO-TRANSLATIERTEN
PROTEINEN
45
BANDSHIFT-EXPERIMENTE
ZUR
DARSTELLUNG
VON
PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN
46
DAB-KOMPLEX-BANDSHIFT
47
2.11.
ISOLIERUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
47
2.11.1.
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
47
2.11.2.
REINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
48
2.3.
ZELLKULTURTECHNIKEN
50
2.3.1.
ZELLINIE
50
2.3.2.
ZELLPFLEGE
50
2.3.3.
TRANSFEKTION
51
2.3.3.1.
VORBEREITUNG
DER
ZELLEN
51
2.3.3.2.
CALCIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION
51
2.3.4.
QUANTIFIZIERUNG
VON
GEN-AKTIVITAETEN
52
2.3.4.1.
HERSTELLUNG
VON
SCHNEIDER-ZELLEXTRAKTEN
52
2.3.4.2.
BESTIMMUNG
DER
REFERENZGEN-AKTIVITAET
53
2.3.4.3.
BESTIMMUNG
DER
CAT-AKTIVITAET
54
2.3.4.3.1.
"CAT-ASSAY"
54
2.3.4.3.2.
"CAT-ELISA"
56
3.
ERGEBNISSE
57
3.1.
UNTERSUCHUNGEN
SUR
BESTIMMUNG
DES
REGULATORISCHEN
POTENTIALS
VON
KRUEPPEL
57
3.1.1.
ZELLULAERE
LOKALISATION
DER
GAP-GEN-PROTEINE
IN
TRANSFEKTIERTEN
SCHNEIDER-ZELLEN
59
3.1.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT
DER
KRUEPPEL-ABHAENGIGEN
GENEXPRESSION
62
3.1.3.
FUNKTIONELLE
STRUKTURANALYSE
VON
KRUEPPEL
68
3.1.4.
UNTERSUCHUNG
ZUR
REGULATORISCHEN
EIGENSCHAFT
VON
KRUEPPEL
IN
EINEM
HETEROLOGEN
IN
VITRO-SYSTEM
79
3.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MECHANISMUS
DER
REGULATORISCHEN
DOPPELFUNKTION
VON
KRUEPPEL
8
3
3.2.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
KONZENTRATIONSABHAENGIGEN
HOMODIMERISATION
VON
KRUEPPEL
IN
VITRO
83
3.2.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
MECHANISMUS
DER
KRUEPPEL
ABHAENGIGEN
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
IN
VIVO
92
3.2.2.1.
HOMODIMERISIERUNG
VON
KRUEPPEL
IN
ZELLKULTUR
93
3.2.2.2.
EINFLUSS
DER
HOMODIMERISIERUNG
AUF
DIE
REGULATORISCHE
AKTIVITAET
VON
KRUEPPEL
99
3.3.
UNTERSUCHUNG
ZUR
INTERAKTION
VON
KRUEPPEL
MIT
DEM
PRIMAEREN
TRANSKRIPTIONSKOMPLEX
102
3.3.1.
INTERAKTION
VON
KRUEPPEL
MIT
DEN
KOMPONENTEN
DES
PIK
103
3.3.2.
MOLEKULARE
CHARAKTERISIERUNG
DER
KRUEPPEL
:
TFIIB-INTERAKT
ION
109
3.3.3.
EINFLUSS
VON
KRUEPPEL
AUF
DIE
GENEXPRESSION
IN
VITRO
111
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUB
ANDERER
GAP
GEN-PROTEINE
AUF
DAS
REGULATORISCHE
POTENTIAL
VON
KRUEPPEL
116
3.4.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
VON
KNIRPS,
GIANT
TAILLESS
UND
HUNCHBACK
AUF
DIE
KRUEPPEL
-
ABHAENGIGE
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
116
3.4.2.
UNTERSUCHUNGEN
DER
MECHANISMEN
GAP-GEN-PROTEIN-ABHAENGIGER
KRUEPPEL-FUNKT
IONEN
122
3.4.2.1
DIREKTE
INTERAKTION
VON
KRUEPPEL
MIT
GAP-GEN-PROTEINEN
122
3.4.2.2.
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
KRUEPPEL
:
ZIELPROTEIN-HETERODIMERE
130
3.4.2.2.1.
EINFLUSS
VON
GIANT,HUNCHBACK
UND
KNIRPS
AUF
DIE
DNA-BINDUNG
VON
KRUEPPEL
130
3.4.2.2.2.
EINFLUSS
VON
GIANT,HUNCHBACK
UND
KNIRPS
AUF
DEN
KRUEPPEL-KERNTRANSPORT
136
3.4.3.
EFFEKT
DER
GIANT,
KNIRPS
ODER
HUNCHBACK
KO-
EXPRESSION
AUF
DIE
REGULATORISCHE
FUNKTION
VERKUERZTER
KRUEPPEL-DERIVATE
138
3.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
KRUEPPEL
AM
BEISPIEL
DES
GAP-GENS
KNIRPS
142
3.5.1.
KRUEPPEL
AKTIVIERT
ODER
REPRIMIERT
DIE
KX
ELEMENT
VERMITTELTE
GENEXPRESSION
144
3.5.2.
UNTERSUCHUNGEN
DER
GAP-GEN-PROTEIN-ABHAENGIGEN
REGULATORISCHEN
FUNKTION
VON
KRUEPPEL
149
3.5.2.1.
EINFLUSS
VON
HUNCHBACK,
TAILLESS,
GIANT
UND
KNIRPS
AUF
DIE
KX-ELEMENT-VERMITTELTE
GEN-EXPRESSION
149
3.5.2.2.
EINFLUSS
VON
HUNCHBACK,
TAILLESS,
GIANT
UND
KNIRPS
AUF
DIE
KRUEPPEL-ABHAENGIGE
REGULATION
DER
KX-ELEMENT
VERMITTELTEN
GENEXPRESSION
153
3.5.2.2.1.
EINFLUSS
VON
KNIRPS
UND
GIANT
AUF
DIE
KRUEPPEL-ABHAENGIGE
REGULATION
154
3.5.2.2.2.
EINFLUSS
VON
HUNCHBACK
AUF
DIE
KRUEPPEL
ABHAENGIGE
REGULATION
156
3.5.2.2.3.
KRUEPPEL
UND
HUNCHBACK
INTERAGIEREN
UEBER
GROSSE
DISTANZEN
HINWEG
158
3.5.2.2.4.
EINFLUSS
VON
TAILLESS
AUF
DIE
KRUEPPEL
ABHAENGIGE
REGULATION
162
4.
DISKUSSION
163
4.1.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
KRUEPPEL
166
4.1.1.
DIE
DNA-BINDENDE
ZINK-FINGER-DOMAENE
166
4.1.2.
DAS
KERNTRANSPORTSIGNAL
169
4.1.3.
REGULATORISCHE
DOMAENEN
169
4.1.3.1
AIVATOR-DOMAENE
170
4.1.3.2.
REPRESSOR-DOMAENEN
TRD1
UND
TRD2
172
4.1.3.3.
DIE
HOMODIMERISIERUNGS-DOMAENE
(HDD)
175
4.2.
DER
MECHANISMUS
DER
REGULATORISCHEN
DOPPELFUNKTION
VON
KRUEPPEL:
EIN
MODELL
176
4.3.
AKTIVATOR
UND
REPRESSOR:
IST
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
KRUEPPEL
EIN
EINZELFALL?
183
4.4.
REGULATION
DER
JTNI-EXPRESSION
:
MECHANISMEN
DER
KOMBINATORISCHEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-AKTIVITAET
185
4.4.1.
AKTIVIERUNG
UND
REPRESSION
DER
GENEXPRESSION
DURCH
KOMBINATORISCHE
KRUEPPEL-AKTIVITAET
187
4.4.2.
INDIREKTE
UND
DIREKTE
PROTEIN-PROTEIN
INTERAKTIONEN
189
4.4.2.1.
KOMPETITITON
UND
QUENCHING
189
4.4.2.2.
HETERODIMERISIERUNG:
EIN
NEUER
MECHANISMUS
DER
KOMBINATORISCHEN
GAP-GEN-PROTEIN
AKTIVITAET
190
4.4.3.
MODIFIKATION
DER
KRUEPPEL-AKTIVITAET
IN
GEGENWART
ANDERER
GAP-GEN-PROTEINE
193
4.4.4.
REGULATION
DER
KNI-EXPRESSION
IM
EMBRYO:
EIN
VERGLEICH
197
5.
LITERATURLISTE
198
6.
ZUSAMMENFASSUNG
219
LEBENSLAUF |
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