Die Oxidation von sekundären Alkoholen durch methanogene Bakterien: Reinigung und Charakterisierung beteiligter Enzyme
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
L EINLEITUNG. J
1
. OEKOLOGIE UND ENERGETIK DER METHANBAKTERIEN.
1
2
. VERBREITUNG VON ALKOHOLDEHYDROGENASEN.
4
3. DER BIOTECHNOLOGISCHE EINSATZ VON ALKOHOLDEHYDROGENASEN.
4
4. ZIEL DER ARBEIT.
EL MATERIAL UND METHODEN.
6
1. CHEMIKALIEN.
2
. VERWENDETE ORGANISMEN.
6
3. ANZUCHTBEDINGUNGEN UND MEDIEN.
7
3.1. MS-MEDIUM.
7
3.2. ZUSAETZE.
8
4. MASSENKULTUR.G
5. ZELLEMTE.
8
6
. ZELLAUFSCHLUSS.
9
7. ANALYTISCHE METHODEN.
9
7.
1
. WACHSTUMSMESSUNGEN.
9
7.2. LICHTMIKROSKOPIE.
9
7.3. GASCHROMATOGRAPHIE.
9
7.3.1. NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG VON WASSERSTOFF UND METHAN.9
7.3.2. NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG VON ALKOHOLEN UND KETONEN.10
7.4. NACHWEIS VON OPTISCH AKTIVEN ALKOHOLEN IN KULTURFLUESSIGKEITEN.10
7.5. PROTEINBESTIMMUNGSMETHODEN.
11
7.5.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD.
11
7.5.2. PROTEINBESTIMMUNG NACH LOWRY.
11
7.6. ENZYMATISCHE MESSUNGEN.12
7.6.
1
. NACHWEIS DER ADH-AKTIVITAET MIT NADP+ ALS COFAKTOR.12
7.6.2. NACHWEIS DER ADH-AKTIVITAET MIT F
420
ALS COFAKTOR.13
7.6.3. NACHWEIS EINER NADPH:F420 -OXIDOREDUKTASE-AKTIVITAET.13
7.7 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN KONSTANTEN KC
AT/KM.13
7.8. BESTIMMUNG DER AKTIVIERUNGSENERGIE.14
7.9. BESTIMMUNG DES METALLGEHALTS VON PROTEINEN MIT ICP.14
7.10. N-TERMINALE SEQUENZIERUNG VON PROTEINEN.15
7.11. BESTIMMUNG DER MOLEKULARGEWICHTE VON GEREINIGTEN ENZYMEN MIT
FPLC.15
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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7.12. BESTIMMUNG DER UNTEREINHEITEN VON PROTEINEN MIT SDS/PAGE-GELEN.15
7.12.1. PROTEINFARBUNG MIT COOMASSIE BRILLIANT BLUE.16
7.12.2. FAERBUNG VON PROTEINEN UND 1,2 DIOL-GRUPPEN.17
8. ISOLIERUNG UND REINIGUNG DES METHANOGENEN COFAKTORS F
420.17
8.1. ISOLIERUNG VON F
420 NACH LITERATURVORSCHRIFT.17
8.2. VERWENDUNG VON GANZEN ZELLEN.17
8.3. AUFARBEITUNG VON F
420 AUS ELUTIONSRUECKSTAENDEN.18
8.4. BESTIMMUNG DER REINHEIT DES PRAEPARATES MIT HPLC.19
8.5. BESTIMMUNG DER KONZENTRATION DES COFAKTORS F
420.19
8.6. HERSTELLUNG VON REDUZIERTEM COFAKTOR F
420.19
9. PROTEINREINIGUNGSPROZEDUREN.19
9.1. REINIGUNG DER ADH VON
MB. PALUSTRE.19
9.2. REINIGUNG DER ADH VON MG. LIMINATANS.20
9.3. REINIGUNG DER ADH VON
MCP. PARVUM.21
9.4. REINIGUNG DER ADH VON
MCP. BAVARICUM.22
9.5. REINIGUNG DER NADPH:F
42O-OXIDOREDUKTASE VON MB. PALUSTRE STAMM AL.22
10. IMMUNOLOGISCHE PROZEDUREN.23
10.1. HERSTELLUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN.23
10.2. AUFREINIGUNG UND KONZENTRIERUNG VON ANTIKOERPERN.23
10.3. IMMUNDIFLUSIONSTEST.24
10.4. WESTEMBLOT.25
11. NACHWEIS VON ADH-AKTIVITAET AN GANZEN ZELLEN.26
11.1 NACHWEIS DER INDUKTION DER ADH MIT DEM NEUTRAL-ROT-TEST.26
11.2. STANDARDTEST FUER DIE UMSETZUNG VON SEKUNDAEREN ALKOHOLEN.26
11.3. IDENTIFIZIERUNG VON ADH-UNTEREINHEITEN DURCH INDUKTION.26
HI. ERGEBNISSE. .28
1. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON FAKTOR F
420.28
2. STIMULIERUNG DES WACHSTUMS VON
METHANOCORPUSCULUM BAVARICUM
DURCH PANSENSAFT UND ERSATZ VON PANSENSAFT DURCH COM.30
3. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ADH VON
MB. PALUSTRE
UND
MG. LIMINATANS.31
3.1. DIE REINIGUNG DER ADH VON MB. PALUSTRE UND MG. LIMINATANS
UND STABILITAET DER ENZYME.31
3.2. DER EINFLUSS VON TEMPERATUR, PH-WERT UND SALZKONZENTRATION AUF
DIE AKTIVITAET DER ADHS.35
3.3. DIE KATALYTISCHE AKTIVITAET UND KINETISCHE KONSTANTEN DER ADH VON
MB. PALUSTRE
UND MG. LIMINATANS.38
3.4. INHIBITOREN DER ADH VON
MB. PALUSTRE UND MG. LIMINATANS.41
3.5. METALLGEHALT UND UV-VIS-SPEKTREN.42
3.6. N-TERMINALE SEQUENZIERUNG DER ADH VON
MB. PALUSTRE UND
MG. LIMINATANS
.43
4. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ADH VON
MCP. PARVUM UND
MCP. BAVARICUM
.44
4.1. REINIGUNG UND STABILITAET DER ENZYME.44
4.2. DER EINFLUSS VON TEMPERATUR, PH-WERT UND SALZGEHALT AUF DIE
AKTIVITAET
DER ADHS.49
4.3. KATALYTISCHE AKTIVITAET UND KINETISCHE KONSTANTEN DER ADH VON
MCP. PARVUM
UND MCP. BAVARICUM.52
4.4. HEMMUNG DER ADH-AKTIVITAETEN VON
MCP. PARVUM UND MCP. BAVARICUM.56
4.5. METALLGEHALT BEI DER ADH VON
MCP. PARVUM UND MCP. BAVARICUM
UND UV-VIS-SPEKTREN.58
4.6. N-TERMINALE SEQUENZIERUNG DER ADH VON
MCP. PARVUM UND
MCP. BAVARICUM
.59
5. IMMUNOLOGISCHER VERGLEICH VON ALKOHOLDEHYDROGENASEN MIT
POLYKLONALEN ANTIKOERPERN.60
5.1. UNTERSUCHUNG VON ZELLFREIEN ROHEXTRAKTEN MIT DEM
DOPPELDIFFUSIONSTEST.60
5.2. IMMUNOLOGISCHE REAKTION VON GEREINIGTEN ENZYMEN UND
ALKOHOLDEHYDROGENASEN NACH WESTEMBLOT.63
6. UNTERSUCHUNGEN ZU STEREOSPEZIFISCHEN UMSETZUNGEN VON
SEKUNDAEREN ALKOHOLEN UND KETONEN.64
6.1. BESTIMMUNG VON VMAX UND KM-WERTEN FUER OPTISCH AKTIVE ALKOHOLE.64
6.2. BESTIMMUNG VON K
M-WERTEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER TEMPERATUR.64
6.3. DIE ABHAENGIGKEIT DER ENANTIOMERENDISKRIMINIERUNG VOM PH-WERT
UND SALZGEHALT.66
6.4. DIE REDUKTION VON KETONEN ZU OPTISCH AKTIVEN ALKOHOLEN
DURCH GANZE ZELLEN.68
7. NADPH:F420-OXIDOREDUKTASEAKTIVITAET.69
7.1. DIE INDUKTION DER OXIDOREDUKTASEAKTIVITAET.69
7.2. REINIGUNG DER NADPH:F420-OXIDOREDUKTASE AUS MB. PALUSTRE STAMM
AL.69
7.3. TEMPERATUR-, PH- UND SALZOPTIMA DER NADPH:F
420-OXKLOREDUKTASE.72
7.4. DIE KATALYTISCHE AKTIVITAET UND KINETISCHE KONSTANTEN DER
OXIDOREDUKTASE.74
7.5. INHIBITOREN DER NADPH:F
420-OXIDOREDUKTASEAKTIVITAET.76
7.6. METALLANALYSE UND UV-VIS-SPEKTRUM DER OXIDOREDUKTASE.76
7.7. N-TERMINALE SEQUENZIERUNG DER OXIDOREDUKTASE.77
7.8. TRANSHYDROGENASE REAKTIONEN BEI DER FAMILIE
METHANOCORPUSCULACEAE.77
8. UNTERSUCHUNG DER INDUKTION DER ADH-AKTIVITAET.79
8.1. DER EINFLUSS VON VERSCHIEDENEN ALKOHOLEN UND KETONEN
AUF DIE INDUKTION.79
8.2. DER EINFLUSS DER SUBSTRATKONZENTRATION AUF DIE INDUKTION DER ADH.83
8.3. DER EINFLUSS DES WASSERSTOFLPARTIALDRUCKES AUF DIE INDUKTION DER
ADH.84
9. UMSATZLEISTUNGEN VON ALKOHOL-OXIDIERENDEN METHANBAKTERIEN.84
10. KURZCHARAKTERISIERUNG VON
METHANOBACTERIUM STAMM AL.86
IV. DISKUSSION.
1. EIGENSCHAFTEN DER ALKOHOL-DEHYDROGENASEN.89
1.1 SUBSTRATE DER ADHS.92
1.2. COFAKTOREN DER ADHS.92
1.3. GROESSE DER UNTEREINHEITEN.93
1.4. BESTIMMUNG N-TERMINALER SEQUENZEN.93
1.5. IMMUNOLOGISCHER VERGLEICH DER ADHS.95
2. DIE TRANSHYDROGENASE ALS TEIL DES ALKOHOL-OXIDIERENDEN SYSTEMS.95
3. DIE METHANOGENESE BEI VERWENDUNG VON ALKOHOL/C02.98
4. DIE REGULATION DER EXPRESSION. 99
V. ZUSAMMENFASSUNG.101
VL LITERATUR.1
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