Katabolismus des 5-Fluoruracil in Säugetierzellen: Dihydropyrimidin-Dehydrogenase
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
1
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1
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1
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1.3.
2.
2
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2.2.1.3.
2.2.1.4.
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2.2.1.4.2
2.2.1.43
2
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2
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2
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2.2.2.3.
2.2.2.4.
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
2.3.3.
23.3.1.
2.3.3.2.
2.3.3.3.
2
.
3
.
3
.
4
.
EINLEITUNG 1
PYRIMIDINKATABOLISMUS UND SEINE PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG 1
WIRKUNGSWEISE DES 5-FLUORURACIL 2
ZIEL DER STUDIEN AN DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE S
ERGEBNISSE UND DISKUSSION 7
REINIGUNG DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE AUS
SCHWEINELEBER
7
CHARAKTERISIERUNG DES SCHWEINELEBERENZYMS G
NATIVES ENZYM
9
MOLEKULARGEWICHT
9
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG UND ISOELEKTRISCHER PUNKT 10
UV/VIS-ABSORPTIONSSPEKTREN, DIFFERENZSPEKTREN IN GEGEN
WART VON SUBSTRATEN
11
COFAKTOR-GEHALT
14
FLAVINNUKLEOTIDE
14
METALLIONENGEHALT
15
SAEURELOESLICHES SULFID
16
FRAGMENTE DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASEN-UNTEREINHEIT
17
FRAGMENTIERUNG MIT BROMCYAN UND AMINOTERMINALE SEQUENZEN 17
TRENNUNG DER FRAGMENTE 20
CHARAKTERISIERUNG DER FRAGMENTE 22
STRUKTURELLER ZUSAMMENHANG DER VIER PEPTIDE AUS DIHYDRO
PYRIMIDIN-DEHYDROGENASE 24
POSTSYNTHETISCHE MODIFIZIERUNGEN AN DIHYDROPYRIMIDIN-
DEHYDROGENASE
26
DESAMIDIERUNGEN VON ASPARAGIN- ODER GLUTAMINRESTEN,
SPALTUNGEN DER PEPTIDKETTE AN ASPARAGINRESTEN 28
OXIDATIVE MODIFIZIERUNGEN 29
VERAENDERUNGEN AN DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE 30
INKUBATION DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE UNTER
DESAMIDIERUNGSBEDINGUNGEN
31
BILDUNG VON KOVALENT VERNETZTEN AGGREGATEN 32
BILDUNG NICHT-KOVALENT VERNETZTER AGGREGATE 33
UMWANDLUNG DER NICHTKOVALENT VERNETZTEN AGGREGATE IN
KOVALENT VERNETZTE AGGREGATE
34
-I.
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/940346273
2.3.4. HYPOTHESE: MEHRSTUFIGER ALTERUNGSPROZESS DER DIHYDROPYRIMIDIN-
DEHYDROGENASE
35
2.4. KINETISCHER MECHANISMUS DER ENZYMATISCHEN REDUKTION VON
URACIL 37
2.4.1. ANFANGSGESCHWINDIGKEIT IN ABWESENHEIT VON PRODUKTEN UND
INHIBITOREN 38
2.4.2. PRODUKT-INHIBITION 40
2.4.3. "DEAD-END"-INHIBITOREN
43
2
4.4. ISOTOPENAUSTAUSCH-REAKTIONEN IM GLEICHGEWICHTSZUSTAND 45
2.4.5. POSTULIERTER MECHANISMUS
47
2.5. PH-ABHAENGIGKEIT DER REAKTION, LOSUNGSMITTELISOTOPENEFTEKTE
UND KINETISCHE ISOTOPENEFTEKTE VON STEREOSPEZIFISCH
DEUTERIERTEM COENZYM 48
2.5.1. PH-EFFEKTE AUF DIE ANFANGSGESCHWINDIGKEIT V UND DIE
KINETISCHEN PARAMETER V/KNADPH UND V/KURACIL
49
2.5.2. CYCLO-NADPH ALS SUBSTRATANALOGON
51
2.5.3. PH-ABHAENGIGKEIT DER WIRKUNG VON KOMPETITIVEN INHIBITOREN 52
2.5.4. LOESUNGSMITTELISOTOPENEFFEKTE IN D20
53
2 5.5. KINETISCHE ISOTOPENEFFEKTE DES B-SEITEN DEUTERIERTEN NADP
2H IN
ABHAENGIGKEIT DES PH-WERTES
55
2 5.6. DOPPELTER ISOTOPENEFFEKT: NADP
2H IN D20 55
2
5.7. SAEURE-/BASENKATALYSIERTER MECHANISMUS 56
2.6. STEREOSPEZIFITAET DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE
REAKTION 58
2
.
6
.
1
. NADPH-ABHAENGIGE HALBREAKTION 61
2-6.1.1. KINETISCHE STUDIEN MIT STEREOSPEZIFISCH DEUTERIERTEN
COENZYMEN
61
26.1.2. ^H-NMR-SPEKTROSKOPISCHE MESSUNGEN 63
2
.
6
.
2
. URACIL-ABHAENGIGE HALBREAKTION 64
2.6.3. ZUSAMMENFASSUNG: STEREOSPEZIFITAET 65
2.7. NACHWEIS DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE IN HIRNGEWEBE 66
3. EXPERIMENTELLER TEIL 71
3.1. REINIGUNG DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE AUS
SCHWEINELEBER 71
3.1.1. ROHEXTRAKT, AMMONIUMSULFATFRAKTIONIERUNG UND BEHANDLUNG BEI
PH 4,85 71
3.1.2. CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-CELLULOSE 71
3.1.3. CHROMATOGRAPHIE AN
2',
5'-ADP-SEPHAROSE
72
3.2. ENZYM ASSAY 73
3.3. PROTEINBESTIMMUNG 73
-II-
74
3.4.
3.4.1.
3.4.2.
3.5.
3.5.1.
3.5.2.
3.6.
3.6.1.
3.6.2.
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3.7.1.
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3.8.1.1.
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3.8.2.2.
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3.8.3.1.
3.8.32.
3.8.4.
3.8.4.1.
3.8.4.2.
3.
8
.4.3.
3.9.
3.10.
3.10.1.
3.10.2.
3.11.
3.11.1.
3.11.2.
3.11.2.1
3.11.2.2
CHROMATOGRAPHISCHE MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNGEN
BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS DER NATIVEN DIHYDRO-
PYRIMIDIN-DEHYDROGENASE MIT HILFE VON MOLEKULARSIEBCHROMATO
GRAPHIE AN SEPHACRYL-S-400HR
74
BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS DES NICHT-KOVALENTEN UND
DES KOVALENTEN AGGREGATES MIT HILFE EINER MOLEKULARSIEB
CHROMATOGRAPHIE AN SUPERDEX 200
75
FLAVINBESTIMMUNGEN 75
QUALITATIV: HPLC-ASSAY
76
QUANTITATIV: FLUOROMETRISCHE METHODE 76
METALLBESTIMMUNGEN
76
ATOMABSORPTIONSSPEKTROSKOPIE
76
EISENBESTIMMUNG MIT DER FERROZINMETHODE
77
BESTIMMUNG DES SAEURELOESLICHEN SULFIDS
77
METHYLENBLAUMETHODE
77
JODOMETRISCHE BESTIMMUNG DER NATRIUMSULFID-EICHLOESUNG 78
ELEKTROPHORETISCHE METHODEN 79
ANALYTISCHE GELELEKTROPHORESEN
79
POLYACRYLAMID-GELE IN GEGENWART VON SDS
79
NATIVE POLYACRYLAMID-GELE
80
HOMOGENE POLYACRYLAMIDKONZENTRATION 80
GRADIENTENGELE 81
ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 82
PRAEPARATIVE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 83
PRAEPARATIVE PAGE IN GEGENWART VON SDS 83
PRAEPARATIVE PAGE IN NATIVEN GELE 84
TRANSFER AUF IMMOBILISIERENDE MEMBRANEN: WESTEMBLOTTING 84
TRANSFER AUF NITROCELLULOSE 84
TRANSFER AUF POLYVINYLIDENDIFLUORIDMEMBRANEN (PVDF) 85
NACHWEISMETHODEN FIIR PROTEINE NACH ELEKTROPHORETISCHER
TRENNUNG
85
SILBERFAERBUNG
85
FAERBUNG MIT COOMASSIE BLUE
86
IMMUNOFARBUNG VON NITROCELLULOSEBLOTS MIT HILFE POLYKLONALER
ANTIKOERPER
86
SPALTUNG MIT BROMCYAN
87
AMINOSAEUREANALYTIK
87
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG 87
AMINOTERMINALE SEQUENZEN 87
KINETISCHE EXPERIMENTE 88
MESSUNGEN DER ANFANGSGESCHWINDIGKEIT, PUFFERSYSTEME
88
ISOTOPENAUSTAUSCHREAKTIONEN IM GLEICHGEWICHT
88
NADP
+/NADPH-ISOTOPENAUSTAUSCHREAKTION
88
THYMIN/5,6-DIHYDROTHYMIN-ISOTOPENAUSTAUSCHREAKTION 89
-III-
3.11.3.
3.11.3.1.
3.11.3.2.
3.11.3.3.
3.11.4.
3.12.
3.12.1.
3.12.2.
3.12.3.
3.12.4.
3.12.4.1.
3.12.4.2.
3.12.5.
3.12.5.1.
3.12.5.2.
3.12.5.2.1
3.12.5.2.2
3.12.5.3.
3.12.6.
3.13.
3.14.
3.14.1.
3.14.1.1.
3.14.1.2.
3.15.
3.16.
3.16.1.
3.16.2.
3.16.3.
3.16.4.
4.
5.
6
.
ISOTOPENEFFEKTE 89
ISOTOPENEFFEKTE DES LOESUNGSMITTELS 89
ISOTOPENEFFEKTE STEREOSPEZIFISCH DEUTERIERTER COENZYME 89
DOPPELTE ISOTOPENEFFEKTE 90
BERECHNUNG DER KINETISCHEN PARAMETER 90
SYNTHESEN
91
[U
14C]-NADP+ 91
[4
2H]-NADP+ 91
C-NADPH 92
STEREOSPEZIFISCH DEUTERIERTE COENZYME 92
A-SEITEN-NADP
2H MIT MALAT-ENZYM 92
A-SEITEN- ODER B-SEITEN-NADP
2H MIT GLUCOSE-
DEHYDROGENASE 92
REINIGUNGS- UND NACHWEISMETHODEN FUER NICOTINAMIDADENIN-
DINUKLEOTIDE
93
TRENNUNG VON NADP
+/NAD+
93
TRENNUNG VON NADPH/NADP
+
93
CHROMATOGRAPHIE AN LICHROSPHER 1000 DEAE
93
CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW
93
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE TRENNUNG VON NADP+
NADPH, NAD+ UND NADH '
94
UMSETZUNG VON NADP
2H MIT DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE
94
^H-NMR-SPEKTROSKOPIE
94
POSTSYNTHETISCHE MODIFIZIERUNGEN
95
INKUBATIONEN ZUR HERSTELLUNG UND UMWANDLUNG MODIFIZIERTER
FORMEN DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE
95
AMMONIAKBESTIMMUNGEN
95
TRENNUNG VON NATIVER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE UND
NICHT-KOVALENTE VERNETZTE AGGREGATEN
95
NACHWEIS DER DIHYDROPYRIMIDIN-DEHYDROGENASE IN HIRNGEWEBE 96
POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN DIHYDROPYRIMIDIN-
DEHYDROGENASE AUS SCHWEINELEBER
97
IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN
97
CHARAKTERISIERUNG DER POLYKLONALEN ANTIKOERPER: ELISA
97
REINIGUNG DER ANTISEREN 98
FRAGMENTIERUNG DER IMMUNGLOBULINE MIT PEPSIN 98
ZUSAMMENFASSUNG 100
AUSBLICK 105
LITERATURVERZEICHNIS 107
-IV- |
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