Charakterisierung eines spezifischen Membranrezeptors für das regulatorische Peptid "Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide" (PACAP):
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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I
I.
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
2.
2.1.
2.1.1
2.1.2.
2.1.3.
MATERIAL
UND
METHODEN
6
MATERIAL
6
CHEMIKALIEN,
REAGENZIEN
UND
ENZYME
6
GERAETE
8
UNTERSUCHUNGSMATERIAL
9
2.2.
SYNTHESE,
IODIERUNG
UND
BIOTINYUERUNG
VON
PEPTIDEN
10
2.2.1.
2.2.1.1.
2.2.1.2.
PEPTIDSYNTHESE
10
SYNTHESEVERLAUL
10
ABSPALTUNG
VOM
SYNTHESEHARZ
10
2.2.2.
2.2.2.1.
22.2.2.
2.2.23.
PEPTIDIODIERUNG
11
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
11
DURCHFUEHRUNG
DER
LODIERUNG
12
AUFTRENNUNG
DER
LODIERUNGSPRODUKTE
12
2.2.3.
2.2.3.1.
2.2.3.2.
2.2.3.3.
2.2.S.4.
BIOTINYLIERUNG
VON
PEPTIDEN
12
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
12
DURCHFUEHRUNG
DER
BIOTINYLIERUNG
13
TESTUNG
DER
BINDUNGSAKTIVITAET
DER
BIOTINYLIERTEN
PEPTIDE
13
KOPPLUNG
AN
STREPTAVIDIN-SEPHAROSE
13
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
2.3.3.
MEMBRANPRAEPARATION
14
VERWENDETE
GEWEBE
14
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
14
DURCHFUEHRUNG
15
2.4.
REZEPTORASSAYS
16
2.4.1.
2.4.1.1.
2.4.1.2.
RADIOREZEPTORASSAY
AN
PLASMAMEMBRANEN
16
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
DURCHFUEHRUNG
EINES
STANDARDASSAYS
(0.5
ML)
16
II
2.4.1.3.
DISSOZIATIONSEXPERIMENTE
17
2.4.1.4.
SAETTIGUNGSASSAYS
MIT
IODIERTEM
PEPTID
17
2.4.1.5.
REZEPTORASSAYS
MIT
[1251]
STREPTAVIDIN
17
2.4.2.
RADIOREZEPTORASSAY
AN
SOLUBILISIERTEM
REZEPTOR
18
2.4.2.1.
VERWENDETE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
18
2.4.2.2.
DURCHFUEHRUNG
18
2.5.
SOLUBILISIERUNG
UND
REZEPTORAUFREINIGUNG
19
2.5.1.
VERWENDETE
PUFFER
19
2.5.2.
SOLUBILISIERUNG
19
2.5.3.
LEKTIN-ADSORPTIONS-CHROMATOGRAPHIE
AN
WEIZENKEIMLEKTIN
20
2.5.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
MAGNETISCH
DOTIERTER
STREPTAVIDIN
SEPHAROSE
20
2.6.
AFFINITAETS-QUERVERNETZUNG
21
2.6.1.
VERWENDETE
PUFFER
21
2.6.2.
DURCHFUEHRUNG
YY.
22
2.7.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
22
2.7.1.
ANALYTISCHE GELCHROMATOGRAPHIE
22
2.7.1.1.
VERWENDETE
PUFFER
22
2.7.1.2.
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
22
2.7.1.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
CHROMATOGRAPHIE
23
2.7.2.
ANALYTISCHE
LEKTIN-ADSORPTIONS-CHROMATOGRAPHIE
23
2.7.2.1.
VERWENDETE
PUFFER
23
2.7.2.2.
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
24
2.7.2.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
CHROMATOGRAPHIE
24
2.7.3.
HIGH
PERFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(HPLC)
25
2.7.3.1.
VERWENDETE
PUFFER
25
2.7.3.2.
DURCHFUEHRUNG
25
2.8.
VERDAU
MIT
GLYKOSIDASE
26
III
2.8.1.
VERWENDETE
PUFFER
2.8.2.
DURCHFUEHRUNG
2.9.
CAMP
BESTIMMUNG
2.9.1.
VERWENDETE
PUFFER
2.9.2.
DURCHFUEHRUNG
2.10.
ELEKTROPHORESETECHNIKEN
UND
AUTORADIOGRAPHIEN
2.10.1.
VERWENDETE
PUFFER
2.10.2.
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
2.10.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
AUTORADIOGRAPHIE
2.11.
ANALYTISCHE
METHODEN
2.11.1.
AMINOSAEURENANALYSE
2.11.1.1.
VERWENDETE
PUFFER
2.11.1.2.
GASPHASENHYDROLYSE
2.11.1.3.
AMINOSAEURENANALYSE
2.11.2.
MASSENSPEKTROMETRIE
2.11.3.
PROTEINBESTIMMUNG
2.12.
VERFAHREN
ZUR
PROTEINKONZENTRIERUNG
2.12.1.
TCA-FAELLUNG
2.12.2.
ACETON-FAELLUNG
2.12.3.
AMICON-KONZENTRIERUNG
2.13.
SCATCHARD-ANALYSE
3.
ERGEBNISSE
3.1.
IDENTIFIKATION
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
2
2
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
3
$
3
3
3
8
8
31
32
32
IV
3.1.1.
SYNTHESE
UND
LODIERUNG
VON
PACAP
32
3.1.2.
IDENTIFIKATION
VON
PACAP-REZEPTOREN
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLINIEN
UND
GEWEBEN
33
3.1.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SPEZIFISCHEN
PACAP-BINDUNG
IM
RATTENGEHIRN
39
3.1.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ASSOZIATION
DES
PACAP-REZEPTORS
MIT
EINEM
GTP-BINDENDEN
PROTEIN
46
3.1.5
BESTIMMUNG
DER
ADENYLATZYKLASEAKTIVIERUNG
UEBER
DEN
PACAP-
REZEPTOR
49
8
3
3
8
3
3
8
3
3
8
3.2
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
PACAP
REZEPTORS
50
3.2.1
STRUKTURELLE
CHARAKTERISIERUNG
DURCH
AFFINITAETSQUERVEMETZUNG
3.2.2
SOLUBILISIERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
3.2.3.
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
DES
SOLUBILISIERTEN
PACAP-REZEPTORS
3.2.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STRUKTURELLEN
ORGANISATION
DES SOLUBILISIERTEN
REZEPTORS
3.2.5
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES SOLUBILISIERTEN
REZEPTORS
3.2.6
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
GLYKOSYLIERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
MITTELS
LEKTINBINDUNGSEXPERIMENTEN
3.2.7
UNTERSUCHUNG
DES
GLYKOSYLIERUNGSGRADES
DES
PACAP-REZEPTORS
MITTELS
GLYKOSIDASEVERDAUUNG
3.3
ANREICHERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
MITTELS
AFFINITAETS
CHROMAETOGRAPHIE
AN
BIOTINYLIERTEN
PACAP-ANALOGEN
3.3.1
BIOTINYLIERUNG
VON
CYSTEINHALTIGEN
PACAP-ANALOGEN
3.3.2
BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
BIOTINYLIERTEN
ANALOGEN
3.3.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
TERNAERKOMPLEXBILDUNG
AUS BIOTINYLIERTEN
PACAP
ANALOGEN,
STREPTAVIDIN
UND
DEM
PACAP-REZEPTOR
66
3.3.4
ANREICHERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
MITTELS
LEKTIN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
68
3,3.5
ANREICHERUNG
DES
PACAP-REZEPTORS
MITTELS
LIGANDEN
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
70
V
4.
DISKUSSION
74
4.1.
IDENTIFIKATION
DES
PACAP-REZEPTORS
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DESSEN
FUNKTION
74
4.2.
STRUKTURELLE
UND
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG DES
PACAP-1
REZEPTORS
83
4.3.
AUSARBEITUNG
EINER
AUFREINIGUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
PACAP-1
REZEPTOR
88
5.
ZUSAMMENFASSUNG
93
6.
LITERATURVERZEICHNIS
95 |
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