Expression von Genprodukten des bovinen Papillomvirus Typ 1: biochemische Analyse und Vergleich mit homologen Genprodukten humaner Papillomviren
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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N
INHALT
SEITE
INHALTSVERZEICHNIS
II
ABKUERZUNGEN
VII
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1
PAPILLOMVIREN
UND
KANZEROGENESE
.
1
1.2
GENOMORGANISATION
.
2
1.3
REPLIKATION
DER
PAPILLOMVIREN
.
6
1.4
ZIEL
DER
ARBEIT
.
9
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
10
2.1
MATERIAL
.
10
2.1.1
BAKTERIEN,
PLASMIDE
UND
ZELLINIEN
.
10
2.1.2
ENZYME
.
11
2.1.3
MARKIERTE
ANTIKOERPER
.
11
2.1.4
CHEMIKALIEN
.
11
2.1.5
RADIOCHEMIKALIEN
.
11
2.1.6
MEMBRANEN
.
12
2.1.7
PROTEINE
.
J
.
12
2.1.8
STAMMLOESUNGEN,
PUFFERSYSTEME
UND
NAEHRMEDIEN
.
12
2.2
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
UND
BEARBEITUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
19
2.2.1
TRANSFORMATION
.
19
2.2.2
PRAEPARATION
VON
DNA
.
20
2.2.2.1
ANALYTISCHE
PLASMIDISOLIERUNG
.
20
2.2.2.2
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
.
20
2.2.3
KONZENTRIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
21
2.2.4
GELELEKTROPHORESEN
.
22
2.2.4.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
22
2.2.4.2
REISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSE
UND
POLYACRYLAMIDGELEN
.
22
2.2.4.3
POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE
.
23
2.2.4.4
SEQUENZGELE
.
23
2.2.4.5
TROCKNUNG
VON
RADIOAKTIVEN
NICHT-SEQUENZGELEN
.
24
2.2.4.6
TEMPERATURGRADIENTEN-GELELEKTROPHORESE
(TGGE)
.
25
2.2.5
REAKTIONEN
MIT
DNA-MODIFIZIERENDEN
ENZYMEN
.
25
2.2.5.1
RESTRIKTIONSVERDAUUNGEN
.
25
2.2.5.2
DEPHOSPHORYLIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
26
2.2.5.3
PHOSPHORYLIEREN
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
26
2.2.5.4
AUFFUELLEN
VON
5
'-EINZELSTRANGENDEN
.
27
M
2.2.5.5
T4-DNA-POLYMERASE-REAKTION
.
27
2.2.5.6
MUNG-BEAN-NUKLEASE-VERDAUUNG
.
28
2.2.5.7
ADDITION
VON
LINKEM
.
28
2.2.5.8
LIGATION
.
29
2.2.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
30
2.2.6.1
NICK-TRANSLATION
.
30
2.2.6.2
DIE
5
'
-MARKIERUNG
.
30
2.2.6.3
AUFREINIGUNG
DER
MARKIERTEN
DNA
.
31
2.2.6.3.1
REINIGUNG
DURCH
GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATO
GRAPHIE
.
31
2.2.6.3.2
REINIGUNG
DURCH
LONENAUSTAUSCHCHROMATO
GRAPHIE
(SEP-PAC)
.
31
2.2.7
IN
SITU-DNA-HYBRIDISIERUNG
.
32
2.2.7.1
HYBRIDISIERUNG
MIT
LAENGERKETTIGEN
DNA-FRAGMENTEN
.
32
2.2.7.2
OLIGONUKLEOTIDHYBRIDISIERUNG
.
33
2.2.8
SOUTHERN-BLOT
.
33
2.2.9
AUTORADIOGRAPHIE
.
34
2.2.10
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
UND
-AUFREINIGUNG
.
34
2.2.11
PCR
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION)
.
35
2.2.12
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
37
2.2.12.1
SEQUENZIERUNG
MITTELS
PCR
.
37
2.2.12.2
SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCHMETHODE
VON
SANGER
.
39
2.2.12.3
SEQUENZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
NACH
CASANOVA
.
40
2.3
METHODEN
ZUR
PRAEPARATION
UND
BEARBEITUNG
VON
PROTEINEN
.
41
2.3.1
PROTEINEXPRESSION
.
41
2.3.1.1
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
AUS
SS-GALAKTOSIDASE
UND
EINEM
FREMDEN
GENPRODUKT
MIT
DEM
VEKTOR
PSS20+
UND
COLLAGENASESPALTUNG
.
41
2.3.1.2
MINI-PROTEINEXPRESSION
.
44
2.3.2
AUFREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
44
2.3.2.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MITTELS
APTG-SAEULEN
.
44
2.3.2.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
MIT
IGG-SEPHAROSE
6FF
.
47
2.3.2.3
AUFREINIGUNG
UEBER
FPLC
.
48
2.3.2.4
PARTIELLE
PROTEINAUFREINIGUNG
.
49
2.3.3
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MIT
DEM
"BCA
PROTEIN
ASSAY"
.
49
2.3.4
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
50
IV
2.3.5
WESTEM-BLOT-VERFAHREN
.
51
2.3.5.1
NASSBLOT
.
51
2.3.5.2
SEMI-DRY-ELEKTROBLOT
.
52
2.3.5.3
VERWENDUNG
POLYKLONALER
SEREN
.
52
2.3.5.4
VERWENDUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
53
2.3.5.5
ISOLIERUNG
VON
SPEZIFISCHEN
IMMUNGLOBULINFRAKTIONEN
.
53
2.3.6
GELDIFFUSIONS-TEST
NACH
OUCHTERLONY
.
54
2.3.7
REPLIKATIONS-TEST
.
55
2.3.8
ATPASE-TEST
.
56
2.3.8.1
PHOSPHODIESTERASEAKTIVITAET
.
56
2.3.8.2
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
.
56
2.3.8.3
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
AUF
KIESELGELPLATTEN
.
57
2.3.8.4
BESTIMMUNG
DER
MICHAELIS-KONSTANTEN
KM
.
58
2.3.9
HELIKASE-TEST
.
58
2.3.9.1
HERSTELLUNG
EINZELSTRAENGIGER
M13-PHAGEN
.
58
2.3.9.2
ANNEALING
MIT
SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
59
2.3.9.3
HELIKASE-TEST
.
60
2.3.10
DNA-BINDUNG
IM
SOUTH-WESTERN-BLOT
.
61
2.3.10.1
HERSTELLUNG
BIOTINYLIERTER
DNA
.
61
2.3.10.2
SOUTH-WESTEM-BLOT
MIT
BIOTINYLIERTER
DNA
.
62
2.3.11
PROTEINBINDUNG
IM
WEST-WESTEM-BLOT
.
63
2.3.11.1
HERSTELLUNG
DES
BINDUNGSSUBSTRATS
.
63
2.3.11.2
WEST-WESTEM-BLOT
MIT
PHOSPHORYLIERTEN
PROTEINEN
.
64
2.3.12
IN
VITRO-PHOSPHORYLIEREN
VON
PROTEINEN
.
64
2.4
METHODEN
FUER
ZELLKULTUREN
.
66
2.4.1
KULTIVIERUNG
TRANSFORMIERTER
ZELLINIEN
.
66
2.4.2
LANGZEITLAGERUNG
UND
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN
.
66
2.4.3
HERSTELLUNG
VON
ZELLYSATEN
.
67
2.4.4
GEWINNUNG
VON
KINASEEXTRAKTEN
.
67
2.5
HERSTELLUNG
EINES
POLYVALENTEN
ANTISERUMS
GEGEN
EL
VON
BPV1
.
68
2.5.1
IMMUNISIEREN
VON
KANINCHEN
.
68
2.5.2
BLUTENTNAHME
UND
ANTIKOERPERGEWINNUNG
.
68
2.5.3
BESTIMMUNG
DES
TITERS
DES
ANTISERUMS
.
69
3.
ERGEBNISSE
.
70
3.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DER
GENE
E2
VON
BPV1,
HPV16
UND
HPV
18
UND
IHRE
BIOCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
ANALYSE
.
70
3.1.1
KLONIERUNG
DER
GENE
E2
VON
BPV1,
HPV16
UND
HPV18
.
70
3.1.2
EXPRESSION
UND
DNA-BINDUNG
DER
E2-PROTEINE
BPV1,
HPV16
UNDHPV18
.
74
V
3.1.3
DARSTELLUNG
DES
E2-PROTEINS
IM
IMMUNBLOT
.
75
3.1.4
IMMUNDIFFUSIONS-TEST
NACH
OUCHTERLONY
.
76
3.2
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
EL
VON
BPV1
IN
TEILFRAGMENTEN
UND
ALS
GESAMTPROTEIN
SOWIE
DES
GROSSEN
TUMORANTIGENS
(LARGE
T)
VON
SV40
.
77
3.2.1
KLONIERUNG
DES
GESAMTGENS
EL
.
77
3.2.2
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
EL
VON
BPV1
IN
PRIT2T
.
80
3.2.3
HERSTELLUNG
EINER
SPHL-DELETIONSMUTANTE
(P44)
VON
EL
.
81
3.2.4
KLONIERUNG
VON
P20
.
83
3.2.5
KLONIERUNG
VON
P16
.
84
3.2.6
KLONIERUNG
VON
P10
.
85
3.2.7
IMMUNOLOGISCHE
ANALYSE
DER
EL-PROTEINE
VON
BPV1
.
85
3.2.8
IMMUNBLOT
GEGEN
EL
UNTER
VERWENDUNG
EINES
GEGEN
EL
VON
HPV33
GERICHTETEN
ANTISERUMS
.
87
3.2.9
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
DES
GROSSEN
TUMORANTIGENS
(LARGE
T)
VON
SV40
.
89
3.2.10
SEQUENZIERUNG
DES
LARGE
T
VON
SV40
.
90
3.3
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
BPV1-E1
.
92
3.3.1
ATPASE-TEST
.
92
3.3.1.1
PHOSPHODIESTERASEAKTIVITAET
.
92
3.3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ASSOZIATION
DER
SS-GAL
MIT
E.
COLI- PROTEINEN
.
93
3.3.1.3
ABHAENGIGKEIT
DER
ATPASE-REAKTION
VON
DER
ZUGABE
AKTIVIERTER
KALBSTHYMUS-DNA
.
93
3.3.1.4
BESTIMMUNG
DES
RF-WERTES
.
95
3.3.1.5
BESTIMMUNG
DER
KINETISCHEN
PARAMETER
FUER
DAS
SUBSTRAT
DES
PROTEINS
EL
AUS
BPV1
.
95
3.3.1.6
BEEINFLUSSUNG
DER
ATPASE-AKTIVITAET
DURCH
VERSCHIEDENE
PARAMETER
WIE
DIVALENTE
KATIONEN,
ANTIKOERPER
ODER
PHOSPHORYLIERUNG
DES
ENZYMS
.
97
3.3.2
HELIKASE-TEST
.
97
3.3.3
REPLIKATIONS-TEST
.
98
3.3.4
PHOSPHORYLIERUNG
VON
EL-PROTEINEN
.
99
3.3.5
DIREKTEXPRESSION
DES
GENS
EL
VON
BPV1
DURCH
EINFUEGUNG
EINER
SHINE-DELGAMO-SEQUENZ
UND
NACHWEIS
DES
PRODUKTES
DURCH
PHOSPHORYLIERUNG
.
104
3.3.6
DNA-BINDUNG
DER
EL-PROTEINE
VON
BPV1,
HPV16
UND
HPV18
SOWIE
VON
LT
VON
SV40
.
107
VI
3.3.6.1
COLLAGENASESPALTUNG
DER
EL-PROTEINE
UND
DNA
BINDUNG
DER
VIRALEN
SPALTPRODUKTE
.
108
3.3.6.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
HEMMUNG
DER
DNA-BINDUNG
.
109
3.3.6.3
DNA-BINDUNG
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
SALZKONZENTRATION,
DEM
PH-WERT
UND
ATP
.
110
3.3.6.4
DNA-BINDUNG
VON
PHOSPHORYLIERTEN
EL-PROTEINEN
VON
HPV16
UND
BPV1
.111
3.3.7
BINDUNG
VON
PHOSPHORYLIERTEM
EL
AN
PAPILLOMVIRUSPROTEINE
.
112
3.4
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
E7
VON
BPV1
UND
DES
GENS
E7L1
UND
IHRE
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
.
114
3.4.1
KLONIERUNG
DES
GAIS
E7
VON
BPV1
.
114
3.4.2
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GAIS
E7L1
VON
HPV16
AUS
EINER
LEBERMETASTASE
EINER
ZERVIXKARZINOMPATIENTIN
.
115
3.4.3
SEQUENZIERUNG
VON
E7L1
.
116
3.4.4
DARSTELLUNG
DES
E7L1-PROTEINS
VON
HPV16
IM
IMMUNBLOT
.
116
3.4.5
EXPRESSION
UND
DNA-BINDUNG
DES
E7-PROTEINS
VON
BPV1
.
117
3.4.6
BINDUNG
VON
PHOSPHORYLIERTEM
EL/BPV
AN
E7/BPV
IM
WEST
WESTEM-BLOT
.
119
3.5
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
E8
VON
BPV1
UND
SEINE
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
.
120
3.5.1
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
E8
VON
BPV1
.
120
3.5.2
SEQUENZIERUNG
DES
GENS
E8
VON
BPV1
.
120
3.6
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
GENS
LI
VON
BPV1
UND
SEINE
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
.
122
3.6.1
KLONIERUNG
DES
GENS
LI
VON
BPV1
.
122
3.6.2
EXPRESSION,
IMMUNBLOT
UND
DNA-BINDUNG
DES
PROTEINS
LI
.
123
ANHANG
.
124
NACHWEIS
VON
HPV-DNA
DA
TYPEN
6/11,
16
UND
18
IN
HUMANEN
GEWEBEPROBAI
MITTELS
PCR
.
124
A.
1
ISOLIERUNG
DA
DNA
.
124
A.2
PCR-DURCHFUEHRUNG
.
124
A.3
UEBERPRUEFUNG
DA
SPEZIFITAET
DA
PRODUKTBILDUNG
MITTELS
SOUTHERN
BLOT
.
125
A.4
BESTIMMUNG
DA
EMPFINDLICHKEIT
DES
DNA-NACHWEISES
.
126
A.5
VERTEILUNG
DER
POSITIVEN
DNA-NACHWEISE
.
127
4.
DISKUSSION
.
128
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
134
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
135 |
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