Untersuchungen zur Struktur und Funktion des mitochondrialen Rezeptorkomplexes:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
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1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
SORTIERUNGSSIGNALE
IN
PROTEINEN
.
1
1.2.
ERKENNUNG
VON
SORTIERUNGSSIGNALEN
IN
DER
ZELLE
.
6
1.3.
FRAGESTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
.
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
14
2.1.
VERWENDETE
STAEMME
VON
E.
COLI-,
NEUROSPORA
CRASSA
UND
S.
CEREVISIAE
(HEFE)
.
14
2.2.
PRAEPARATION
VON
DNS
.
14
2.2.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNS
.
14
2.2.2.
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNS
.
16
2.2.3.
AMPLIFIKATION
VON
DNS
.
17
2.3.
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
DNS
.
18
2.3.1.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
.
18
2.3.2.
GELELEKTROPHORESE
.
18
2.3.3.
TRANSFER
UND
NACHWEIS
VON
DNS
AUF
NYLON
MEMBRANEN
.
19
2.3.4.
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
19
2.3.5.
REINIGUNG
VON
IN
VITRO
SYNTHETISIERTEN
OLIGO
NUKLEOTIDEN
.
20
2.4.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNS
.
20
2.4.1.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNS
.
20
2.4.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
ALKALI
SCHER
PHOSPHATASE
20
2.4.3.
LIGATION
VON
VEKTOR
UND
DNS-FRAGMENTEN
MIT
DER
T4-LIGASE
.
21
2.4.4.
SL-VERDAU
VON
LINEAREN
DNS-FRAGMENTEN
.
21
2.4.5.
AUFFUELLEN
UEBERHAENGENDER
DNS-ENDEN
MIT
DEM
KLENOW
FRAGMENT
DER
E.CO/I-DNS-POLYMERASE
I
.
21
2.4.6.
MARKIERUNG
VON
DNS
MIT
32
P
(NICKTRANSLATION)
.
22
2.4.7.
DNS-SEQUENZIERUNG
.
22
2.5.
TRANSFORMATION
VON
MIKROORGANISMEN
MIT
REKOMBINANTER
PLASMID-DNS
.
23
2.5.1.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
MIT
PLASMIDEN
.
23
2.5.2.
INFEKTION
VON
BAKTERIEN
MIT
LAMBDA-PHAGEN
.
24
2.5.3.
AMPLIFIKATION
VON
LAMBDA-PHAGEN
.
24
2.6.
DURCHMUSTERUNG
VON
GENBANKEN
.
25
2.6.1.
DURCHMUSTERUNG
VON
GENBANKEN
IN
XGTLL
MIT
ANTI
KOERPERN
.
25
2.6.2.
DURCHMUSTERUNG
VON
BAKTERIENKOLONIEN
MIT
ANTI
KOERPERN
.
25
2.7.
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
26
2.7.1.
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
NEUROSPORA
CRASSA
.
26
2.7.2.
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
27
2.7.3.
SUBFRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
27
2.7.3.1.
ISOLIERUNG
MITOCHONDRIALER
AUSSENMEMBRAN
.
27
2.7.3.2.
FRAKTIONIERUNG
DURCH
ALKALISCHE
BEHANDLUNG
(NAIC
O
3-EXTRAKTION)
.
28
2.7.3.3.
FRAKTIONIERUNG
DURCH
ULTRASCHALL
.
28
2.7.3.4.
HERSTELLUNG
MITOCHONDRIALER
DETERGENS-EXTRAKTE
.
28
2.7.4.
VORBEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
29
2.7.4.1.
PROTEASE-VORBEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
29
2.7.4.2.
APYRASE-VORBEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
29
2.7.4.3.
VORINKUBATION
VON
MITOCHONDRIEN
MIT
ANTIKOERPERN
.
29
2.7.4.4.
VORINKUBATION
VON
MITOCHONDRIEN
MIT
8-AZIDO-ATP
.
30
2.7.4.5.
ERZEUGUNG
VON
HEFE-MITOPLASTEN
DURCH
OSMOTISCHEN
SCHOCK
.
30
2.7.5.
IMPORT
IN
VITRO
SYNTHETISIERTER
VORSTUFEN
IN
ISOLIERTE
MITOCHONDRIEN
.
30
2.8.
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
33
2.8.1.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
33
2.8.2.
AUTORADIOGRAPHIE
UND
FLUOROGRAPHIE
VON
POLYACRYL
AMIDGELEN
.
33
2.8.3.
TRANSFER
UND
ANALYSE
ELEKTROPHORETISCH
AUFGETRENNTER
PROTEINE
AUF
NITROZELLULOSE
(WESTERN-BLOT)
.
34
2.8.4.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
34
2.8.5.
RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNG
DURCH
FLUESSIGSZINTILLATIONS
ZAEHLUNG
.
34
2.9.
PRAEPARATION
VON
PROTEINEN
.
35
2.9.1.
SYNTHESE
VON
MITOCHONDRIALEN
VORLAEUFERPROTEINEN
IN
VITRO
.
35
2.9.1.1.
HERSTELLUNG
VON
RETIKULOZYTENLYSATEN
.
35
2.9.1.2.
TRANSKRIPTION
VON
DNS-INSERTS
MIT
SP6-POLYMERASE
_
35
2.9.1.3.
TRANSLATION
VON
IN
VITRO
SYNTHETISIERTER
MRNS
IN
KANINCHEN-RETIKULOZYTENLYSAT
.
36
2.9.2.
KONZENTRIERUNG
VON
PROTEINEN
AUS
LOESUNGEN
.
37
2.9.2.1.
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
.
37
2.9.2.2.
AMMONIUMSULFATFAELLUNG
.
37
2.9.2.3.
ULTRAFILTRATION
.
37
2.9.2.4.
EINENGUNG
MIT
PEG-8000
38
2.9.3.
REINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
AUS
E.COLI
.
38
2.9.3.1.
EXPRESSION
IPTG-INDUZIERBARER
PLASMIDE
.
38
2.9.3.2.
EXPRESSION
HITZESCHOCK-INDUZIERBARER
PLASMIDE
.
38
2.9.3.3.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
.
38
2.10.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
39
2.10.1.
KOPPLUNG
SYNTHETISCHER
PEPTIDE
AN
HAEMOCYANIN
.
39
2.10.2.
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTISEREN
.
40
2.10.3.
REINIGUNG
VON
IMMUNGLOBULINEN
(IGG)
.
41
2.10.4.
PRAEPARATION
GEREINIGTER
FAB-FRAGMENTE
.
41
2.10.5.
IMMUNFAELLUNG
.
42
2.10.5.1.
IMMUNFAELLUNG
UNTER
STRINGENTEN
BEDINGUNGEN
.
42
2.10.5.2.
COIMMUNFAELLUNG
.
42
2.10.6.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
IMMOBILISIERTER
PROTEINE
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
(WESTERN-BLOT)
.
42
2.10.7.
QUANTIFIZIERUNG
DER
IMMUNDEKORIERTEN
PROTEINE
IM
'WESTERN-BLOT'
.
43
2.11.
CHEMIKALIEN
UND
GERAETE
.
44
2.11.1.
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
44
2.11.2.
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
45
2.12.
MEDIEN
UND
PUFFER
.
46
3.
ERGEBNISSE
.
49
3.1.
STRUKTUR,
FUNKTION
UND
BIOGENESE
VON
NEUROSPORA
CRASSA
MOM38
.
49
3.1.1.
BESTIMMUNG
DER
PRIMAERSTRUKTUR
VON
MOM38
.
49
3.1.1.1.
DURCHMUSTERUNG
DER
GENBANK
MIT
EINEM
SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER
GEGEN
MOM38
.
49
3.1.1.2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
EINER
MOM38-CDNS
.
50
3.1.1.3.
NUKLEOTIDSEQUENZ
UND
PRIMAERSTRUKTUR
VON
MOM38
.
52
3.1.1.4.
HOMOLOGIE
VON
MOM38
ZU
ISP42
UND
ANDEREN
PROTEINEN
.
52
3.1.2.
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
REZEPTOR
KOMPLEXES
AUS
DER
MITOCHONDRIALEN
AUSSENMEMBRAN
VON
N.CRASSA
.
56
3.1.2.1.
COIMMUNFAELLUNG
DES
REZEPTORKOMPLEXES
MIT
ANTI
M0M19
ANTIKOERPERN
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
MIT
M0M19
ASSOZIIERTEN
PROTEINE
.
56
3.1.2.2.
KORRELATION
DER
PROTEASESENSITIVITAET
DER
GIP-FUNKTION
MIT
DER
VON
MOM38
.
60
3.1.3.
TOPOLOGIE
VON
MOM38
UND
SEINEM
HEFEHOMOLOGEN
ISP42
.
62
3.1.3.1.
ERZEUGUNG
SPEZIFISCHER
PEPTID-ANTIKOERPER
.
62
3.1.3.2.
ZUGAENGLICHKEIT
VON
MOM38
UND
SEINEM
HEFEHOMOLOGEN
ISP42
FUER
PROTEASEN
IN
INTAKTEN
MITOCHONDRIEN
.
67
3.1.3.3.
ZUGAENGLICHKEIT
VON
MOM38
UND
SEINEM
HEFEHOMOLOGEN
ISP42
FUER
PROTEASEN
BEI
GEOEFFNETEM
INTERMEMBRANRAUM
.
71
3.1.4.
MEMBRANINSERTION
UND
ASSEMBLIERUNG
VON
MOM38
.
76
3.2.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
NEUROSPORA
CRASSA
MOM22
.
78
3.2.1.
TOPOLOGIE
VON
MOM22
.
80
3.2.1.1.
ERZEUGUNG
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
GEGEN
MOM22
.
80
3.2.I.2.
IDENTIFIZIERUNG
VON
MOM22
ALS
KOMPONENTE
DES
REZEPTORKOMPLEXES
.
82
3.2.1.3.
LOKALISIERUNG
VON
MOM22
DURCH
ELEKTRONEN
MIKROSKOPIE
.
83
3.2.1.4.
ZUGAENGLICHKEIT
VON
MOM22
FUER
PROTEASEN
.
85
3.2.I.5.
MEMBRANASSOZIATION
VON
MOM22
UND
EINEM
12
KDA
FRAGMENT
VON
MOM22
.
89
3.2.2.
FUNKTION
VON
MOM22
BEIM
TRANSPORT
VON
VORSTUFEN
PROTEINEN
.
89
3.2.2.1.
AUSWIRKUNG
DER
ANTI-MOM22
ANTIKOERPER
AUF
DEN
IMPORT
VON
VORSTUFEN
.
89
3.2.2.2.
AUSWIRKUNG
DER
ANTI-MOM22
ANTIKOERPER
AUF
DIE
BILDUNG
SPEZIFISCHER
VORSTUFEN-INTERMEDIATE
.
92
3.3.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
MOM72
.
95
3.3.1.
WIRKUNG
VON
8-AZIDO-ATP
AUF
DEN
IMPORT
UND
DIE
BILDUNG
SPEZIFISCHER
INTERMEDIATE
DES
ADP/ATP
CARRIERS
IN
N.CRASSA
MITOCHONDRIEN
.
95
3.3.2.
IDENTIFIZIERUNG
MOEGLICHER
AZIDO-ATP-BINDENDER
KOMPONENTEN
DES
MITOCHONDRIALEN
TRANSLOKATIONS
APPARATES
.
100
3.3.3.
WIRKUNG
VON
AZIDO-ATP
AUF
DEN
IMPORT
ANDERER
VORSTUFEN
ALS
AAC
IN
N.CRASSA
MITOCHONDRIEN
.
105
3.3.4.
WIRKUNG
VON
AZIDO-ATP
AUF
DEN
IMPORT
DES
ADP/ATP
CARRIERS
IN
HEFE-MITOCHONDRIEN
.
106
3.3.5.
WIRKUNG
VON
AZIDO-ATP
AUF
DEN
MOM72-UNABHAENGIGEN
IMPORT
DES
ADP/ATP
CARRIERS
.
109
3.3.6.
EINFLUSS
DER
APYRASE-BEHANDLUNG
VON
HEFE-MITOCHON
DRIEN
AUF
DEN
IMPORT
VON
MOM38
IN
WILDTYP
UND
AMOM72/MAS70
MITOCHONDRIEN
.
110
3.3.7.
EINFLUSS
VON
NICHT-HYDROLYSIERBAREN
ATP-ANALOGA
AUF
DIE
INSERTION
DER
VORSTUFE
DES
AAC
IN
DIE
GENERELLE
INSERTIONSPORE
(GIP)
.
113
3.4.
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
VON
MOM55
AUS
N.CRASSA
.
115
4.
DISKUSSION
.
119
4.1.
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
MITOCHONDRIALER
IMPORTKOMPONENTEN
.
119
4.2.
DER
MITOCHONDRIALE
REZEPTORKOMPLEX
.
119
4.3.
STRUKTURELLE
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
MOM38
.
120
4.4.
STRUKTURELLE
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
MOM22
.
124
4.5.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
MOM72
.
126
4.6.
DIE
INITIALEN
SCHRITTE
DES
PROTEINTRANSPORTES
DURCH
DIE
MITOCHONDRIALE
AUSSENMEMBRAN
-
EIN
ARBEITSMODELL
.
129
4.7.
AUSBLICK
.
134
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
135
6.
LITERATUR
136
7.
LEBENSLAUF
.
152
8.
DANKSAGUNG
.
154 |
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