Der induzierbare Transkriptionsfaktor NF-KB: Studien zur Kontrolle des Kerntransportes und zum Mechanismus der Aktivierung
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1993
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1
ZUSAMMENFASSUNG
I
2
EINLEITUNG
3
2.1
DIE
ZENTRALE
FRAGE
3
2.2
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
KOENNEN
AN
GENETISCHE
KONTROLL
ELEMENTE
BINDEN
3
2.3
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
KOENNEN
IN
IHRER
AKTIVITAET
REGU
LIERT
WERDEN
6
2.4
NF
K
B
IST
EIN
MULTIMERER,
INDUZIERBARER
TRANSKRIPTIONS
FAKTOR
7
2.5
ZIELSETZUNG
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
11
3
MATERIAL
UND
METHODEN
13
3.1
MATERIAL
13
3.1.1
PROKARYONTEN
13
3.1.2
EUKARYONTISCHE
ZELLINIEN
13
3.1.3
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
14
3.1.4
OLIGONUKLEOTIDE
15
3.1.5
CHEMIKALIEN
UND
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
17
3.1.6
MOLEKULARBIOLOGISCHE
REAGENZIEN
17
3.1.7
BIOCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
REAGENZIEN
18
3.1.8
ZELLKULTURMATERIAL
19
3.1.9
SONSTIGES
19
3.2
METHODEN
DER
PROKARYONTISCHEN
ZELLKULTUR
20
3.2.1
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
20
INHALUVERZEICHNI
3.2.2
LAGERUNG
VON
ZELLEN
20
3.3
METHODEN
DER
EUKARYONTISCHEN
ZELLKULTUR
20
3.3.1
ZELLKULTURBEDINGUNGEN
20
3.3.2
LAGERUNG
VON
ZELLEN
21
3.4
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
21
3.4.1
GEWINNUNG
VON
PLASMID-DNA
21
3.4.1.1
MINI-PRAEPARATIONEN
21
3.4.1.2
MAXI-PRAEPARATIONEN
22
3.4.2
ANALYSE
VON
PLASMID-DNA
22
3.4.2.1
ABSORPTIONSSPEKTROMETRIE
22
3.4.2.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
22
3.4.2.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
23
3.4.2.4
SEQUENZANALYSE
23
3.4.3
TECHNIKEN
ZUR
KLONIERUNG
REKOMBINANTER
DNA
23
3.4.3.1
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
23
3.4.3.2
GEWINNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
24
3.4.3.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
24
3.4.3.4
LIGATION
24
3.4.3.5
GEWINNUNG
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
25
3.4.3.6
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
MIT
PLASMID-DNA
25
3.4.4
AMPLIFIKATION
VON
DNA
DURCH
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
(PCR)
25
3.4.4.1
ISOLIERUNG
EINES
CDNA-KLONES
AUS
EINER
MENSCHLICHEN
GENBANK
DURCH
PCR
26
3.4.4.2
SCHNELLE
TRANSFORMANTENANALYSE
(PCR-MINIPRAEPARATIONEN)
26
3.4.4.3
HERSTELLUNGVON
DELETIONSMUTANTEN
27
3.4.4.4
HERSTELLUNG
VON
PUNKTMUTANTEN
28
3.4.5
IN
VITRO
EXPRESSION
REKOMBINANTER
DNA
29
3.4.5.1
VORBEREITUNG
DER
DNA-MATRIX
29
3.4.5.2
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
29
3.4.5.3
IN
VITRO
TRANSLATION
30
3.4.5.4
GEKOPPELTE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
(TNT-LYSATE-SYSTEM)
30
3.4.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
30
3.4.6.1
MARKIERUNG
DER
3
'-ENDEN
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
30
3.4.6.2
MARKIERUNG
DER
5
'-ENDEN
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
30
3.4.6.3
REINIGUNG
DER
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTIDE
31
INHALTSVERZEICHNIS
3.5
.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
31
3.5.1
ANALYSE
VON
PROTEINEN
31
3.5.1.1
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
31
3.5.1.2
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
31
3.5.1.3
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
32
3.5.1.3.1
NACHWEIS
DURCH
COOMASSIE-FAERBUNG
32
3.5.1.3.2 NACHWEIS
VON
35
S-MARKIERTEN
PROTEINEN
DURCH
FLUOROGRAPHIE
32
3.5.1.4
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUS
SDS-PA-GELEN
AUF
IMMOBILON-P
MEMBRANEN
32
3.5.1.4.1
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
IMMOBILON-P
MIT
PONCEAU
S
33
3.5.1.5
NACHWEIS
DNA-BINDENDER
PROTEINE
DURCH
GELRETARDIERUNGSANALYSE
(EMSA)
33
3.5.1.6
BESTIMMUNG
DER
INHIBITORISCHEN
AKTIVITAET
VON
1KB-PROTEINEN
34
3.5.1.7
SEDIMENTATIONSANALYSE
MITTELS
GLYCEROLGRADIENTEN
34
3.5.1.8
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
VON
FLUOROGRAMMEN
35
3.5.2
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
MAD-3
IN
E.
COLI
(6MAD-3)
35
3.5.3
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
PRAEPARATIVEN
WESTERN-BLOT
35
3.5.3.1
ELUTION
DER
PROTEINE
VON
IMMOBILON-P-MEMBRANEN
35
3.5.3.2 RENATURIERUNG
VON
ELUIERTEN
PROTEINEN
36
3.5.4
IN
VITRO
PROZESSIERUNG
VON
PL
10
MIT
M-CALPAIN
UND
ZELLEXTRAKTEN
36
3.6
IMMUNCHEMISCHE
METHODEN
37
3.6.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
37
3.6
2
GEWINNUNG
VON
ANTISERUM
37
3.6.3
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
DURCH
IMMUNAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
37
3.6.4
IMMUNDETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
IMMOBILON-P-MEMBRANEN
38
3.6.5
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
35
S-MARKIERTEN
PROTEINEN
38
3.6.6
IMMUNFLUORESZENZNACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
FIXIERTEN
ZELLEN
39
3.7
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
40
3.7.1
EXPRESSION
REKOMBINANTER
DNA
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
40
3.7.1.1
EXPRESSION
IN
ADHAERENTEN
ZELLEN
NACH
TRANSFEKTION
MIT
DEAE/
40
DEXTRAN
3.7.1.2
EXPRESSION
IN
ADHAERENTEN
ZELLEN
NACH
TRANSFEKTION
MIT
KALZIUM
PHOSPHAT
40
3.7.1.3
EXPRESSION
IN
ADHAERENTEN
ZELLEN
NACH
MIKROINJEKTION
41
3.7.2
METABOLISCHE
MARKIERUNG
VON
ZELLEN
MIT
35
S-AMINOSAEUREN
41
3.7.3
BEHANDLUNG
VON
ZELLEN
MIT
NF-KB-AKTIVATOREN
UND
INHIBITOREN
41
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.4
EXTRAKTION
VON
ZELLULAEREN
PROTEINEN
42
3.7.4.1
GEWINNUNG
VON
ZYTOSOL
UND
KERNEXTRAKTEN
42
3.7.4.2
GEWINNUNG
VON
GANZZELLEXTRAKTEN
42
4
ERGEBNISSE
43
4.1
CHARAKTERISIERUNG
ZWEIER
CDNA-KLONE
DER
NF
K
B
UNTEREINHEIT
P65
43
4.1.1
DER
CDNA-KLON
P65
1
EXPRIMIERT
EIN
65
KD
PROTEIN
MIT
DEN
GLEICHEN
DNA-BINDEEIGENSCHAFTEN,
WIE
AUS
HUMANER
PLAZENTA
GEREINIGTES
P65
44
4.1.2
DER
CDNA-KLON
P65-8,
DER
SICH
VON
KLON
P65-L
DURCH
EINE
DELETION
VON
30
BP
UNTERSCHEIDET,
KODIERT
FUER
EIN
PROTEIN,
DAS
NICHT
MEHR
AN
DNA
BINDEN
KANN
45
4.1.3
DER
TRANSPORT
VON
P65
IN
DEN
KEM
IST
KONTROLLIERT
45
4.2
PLLO
-
DAS
VORSTUFENPROTEIN
DER
NF-KB-UNTEREINHEIT
P50
48
4.2.1
DIE
PRIMAERSTRUKTUR
VON
PL
10
48
4.2.2
PL
10
IST
EIN
ZYTOPLASMATISCHES
PROTEIN
49
4.2.3
P50
IST
IM
GEGENSATZ
ZU
PL
10
EIN
KEMPROTEIN
49
4.2.4
FUER
DEN
KEMTRANSPORT
VON
P50
IST
EINE
SEQUENZ
VON
VIER
BASISCHEN
AMINOSAEUREN
VERANTWORTLICH
51
4.2.5
EIN
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
ERKENNT
DAS
KEMTRANSLOKATIONSSIGNAL
IN
P50
NICHT
ABER
IN
PL
10
54
4.2.6
DENATURIERUNG
VON
PL
10
DEMASKIERT
DIE
NLS-SEQUENZ
54
4.2.7
EIN
NUR
UM
190
AMINOSAEUREN
C-TERMINAL
VERKUERZTES
PLLO-MOLEKUEL
(P87)
WIRD
IN
DEN
KEM
TRANSPORTIERT
UND
VON
DEM
ANTI-P50NLS-ANTI-
KOERPER
ERKANNT.
56
4.2.8
C
UND
N-TERMINALE
TEILE
VON
PL
10
INTERAGIEREN
IN
TRANS
59
4.2.9
WEDER
PL
10
NOCH
P87
KOENNE
SPEZIFISCH
AN
DNA
BINDEN
60
4.2.10
PL
10
SEDIMENTIERT
IM
GLYCEROLGRADIENTEN
ALS
MONOMER
62
4.2.11
PL
10
KANN
NUR
IN
VIVO
MIT
P50
UND
P65
ASSOZIIEREN
63
4.2.12
DER
CARBOXYTERMINALE
ANTEIL
VON
PL
10
ERFUELLT
DIE
FUNKTIONEN
EINES
IICB-MOLEKUELS
64
4.2.13
DIE
ZYTOPLASMATISCHE
PROTEASE
CALPAIN
KANN
IN
VITRO
P50
AUS
PL
10
HERAUSSCHNEIDEN
65
INHALTSVERZEICHNIS
4.3
I
K
B
-
DIE
INHIBITORISCHE
UNTEREINHEIT
VON
NF
K
B
68
4.3.1
DER
CDNA-KLON
MAD-3
KODIERT
FUER
EIN
RB-PROTEIN
UND
BESITZT
EINE
AEHNLICHE
STRUKTUR
WIE
DER
CARBOXYTERMINALE
TEIL
VON
PL
10
68
4.3.2
KLONIERUNG
VON
MAD-3
AUS
HUMANER
UTERUS
CDNA
DURCH
PCR
69
4.3.3
DER
E.
COLI-KLON
MAD-3/37-12
EXPRIMIERT
EIN
38
KD
GROSSES
PROTEIN,
DAS
NF-KB/DNA-KOMPLEXE
SPEZIFISCH
DISSOZIIERT
69
4.3.4
EIN
ANTIKOERPER
GEGEN
BAKTERIELLES
MAD-3
REAGIERT
MIT
AUS
PLAZENTA
GEREINIGTEM
HUMANEN
RB-A
JEDOCH
NICHT
MIT
I
K
B
-SS
71
4.3.5
RB-A,/MAD-3
KONTROLLIERT
DEN
KEMTRANSPORT
VON
NF
K
B
DURCH
MASKIERUNG
DER
KEMTRANSLOKATIONSSIGNALE
VON
P50
UND
P65.
72
4.3.6
DIE
FUENF
ANKYRIN-MOTIVE
VON
RB-A/MAD-3
SIND
FUER
DIE
INTERAKTION
MIT
P65
VERANTWORTLICH
75
4.3.7
DIE
ANKYRIN-MOTIVE
VON
RB-A/MAD-3
SIND
FUER
DIE
KEMTRANSPORT
KONTROLLE
VON
P65
AUSREICHEND
78
4.3.8
ZUR
DISSOZIATION
VON
NF-KB/DNA-KOMPLEXEN
SIND
NEBEN
DEN
ANKYRIN-MOTIVEN
ZUSAETZLICHE
BEREICHE
IM
C
UND
N-TERMINUS
VON
I
K
B
O
/MAD-3
NOTWENDIG
80
4.3.9
WEDER
FUSION
DER
180
C-TERMINALEN
AMINOSAEUREN
NOCH
DER
ANKYRIN
MOTIVE
VON
PL
10
KOENNEN
DIE
SPEZIFITAET
VON
RB-A
VERAENDERN
82
4.4
DIE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
86
4.4.1
ENDOGENES
RB-A
KANN
IN
70Z/3-ZELLEN
MIT
DEM
AFFINITAETS-GEREINIGTEN
ANTIKOERPER
ANTI-MAD-3
NACHGEWIESEN
WERDEN
86
4.4.2
NACH
STIMULATION
VON
70Z/3-ZELLEN
MIT
PHORBOLESTER
LAESST
SICH
RB-A
KURZFRISTIG
NICHT
MEHR
IMMUNOLOGISCH
NACHWEISEN
87
4.4.3
DER
ABBAU
VON
RB-A
WIRD
DURCH
DIE
STIMULATION
VON
ZELLEN
MIT
PHORBOLESTER
FAST
UM
ZWEI
ZEHNERPOTENZEN
BESCHLEUNIGT
88
4.4.4
INTERLEUKIN
ISS,
LIPOPOLYSACCHARID
UND
TUMOMEKROSEFAKTOR-A
INDUZIEREN
EBENFALLS
DEN
ABBAU
VON
RB-A
90
4.4.5
DER
ABBAU
VON
RB-A
UND
DIE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
LASSEN
SICH
DURCH
PROTEASEINHIBITOREN
IN
INTAKTEN
ZELLEN
HEMMEN
92
4.4.6
AUCH
DAS
ANTIOXIDANTS
PDTC
BLOCKIERT
DEN
ABBAU
VON
RB-A
93
4.4.7
DER
PROTEOLYTISCHE
ABBAU
VON
RB-A
IST
FUER
DIE
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
NOTWENDIG
94
INHALTSVERZEICHNIS
5
DISKUSSION
5.1
DIE
MASKIERUNG
VON
KERNTRANSLOKATIONSSIGNALEN
-
EIN
NEUES
KONZEPT
ZUR
KONTROLLE
DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS
NF
K
B.
95
5.1.1
5.1.2
5.1.3
INTRAMOLEKULARE
MASKIERUNG
DES
KEMTRANSLOKATIONSSIGNALS
IN
PL
10
95
KONTROLLE
DES
KEMTRANSPORTS
VON
NF
K
B
DURCH
I
K
B
O
97
WARUM
WIRD
P50
ALS
INAKTIVER
VORLAEUFER
SYNTHETISIERT?
99
5.2
DIE
ANKYRIN-MOTIVE:
STRUKTUREN
FUER
DIE
SPEZIFISCHE
PROTEIN-PROTEIN
WECHSELWIRKUNG
101
5.3
AKTIVIERUNG
VON
NF
K
B
DURCH
DEN
INDUZIERBAREN
ABBAU
SEINES
INHIBITORS
IKSS-A
105
6
LITERATUR
113 |
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