Untersuchungen zur Regulation der PHA-Akkumulation, der Mobilisation und zur Granulum-Morphologie in Alcaligenes eutrophus:
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1992
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| adam_text | UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION DER PHA-AKKUMULATION, DER MOBILISATION UND
ZUR GRANULUM-MOI PHOLOGIE IN ALCALIGENES EUTROPHUS DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN
FACHBEREICHE DER GEORG-AUGUST-UNIVERSITAET ZU GOETTINGEN VORGELEGT VON
ANDREAS PRIES AUS WARENDORF GOETTINGEN 1992 INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS SEITE INHALTSVERZEICHNIS I-V ABKUERZUNGEN VI-K 1.
EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN 7 2.1. BAKTERIENSTAEMME UND
PLASMIDE 7 2.2. ZELLANZUCHT UND STAMMHALTUNG 13 2.2.1. NAEHRMEDIEN 13
2.2.2. ANTIBIOTIKA 15 2.2.3. WACHSTUMSBEDINGUNGEN UND ZELLERNTE 15
2.2.4. REINHEITSKONTROLLEN UND STAMMKONSERVIERUNG 16 2.3. ZELLAUFSCHLUSS,
HERSTELLUNG VON ROHEXTRAKTEN UND PROTEINBESTIMMUNGEN 17 2.4. LOESUNGEN 18
2.5. BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 25 2.5.1. SS-GALACTOSIDASE 25 2.5.2.
DIHYDROLIPOAMID-DEHYDROGENASE 26 2.5.3. PYRUVAT BZW.
ACETOIN:DCPIP-OXIDOREDUCTASE 26 2.5.4. DIHYDROLIPOAMID-ACETYLTRANSFERASE
26 2.5.5. PHA-DEPOLYMERASE 27 2.5.6. PHA-SYNTHASE 27 2. 6. SUBSTRAT UND
PRODUKTBESTIMMUNG 2 9 2.6.1. BESTIMMUNG VON AMMONIUM 29 2.6.2.
BESTIMMUNG VON GLUCONAT 29 2.6.3. BESTIMMUNG VON FRUCTOSE 29 2.6.4.
BESTIMMUNG VON PYRUVAT 30 2.6.5. BESTIMMUNG VON 3-HYDROXYBUTYRAT 30
2.6.6. BESTIMMUNG VON PHA 31 2.7. TRANSPOSONMUTAGENESE UND ISOLIERUNG
VON PHA-MUTANTEN 32 2.8. ISOLIERUNG VON NATIVEN PHA-GRANULA 32
INHALTSVERZEICHNIS 2.9. ELEKTROPHORETISCHE METHODEN 33 2.9.1.
POLYACRYLAMIDGEL ELEKTROPHORESE ZUR TRENNUNG VON PROTEINEN 33 2.9.2.
TRANSFER VON PROTEINEN AUS POLYACRYLAMIDGELEN
AUFPVDF-MEMBRANEN(WESTERN-BLOT) 34 2.9.3. POLYACRYLAMIDGEL
ELEKTROPHORESE ZUR TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN 35 2.9.4. AGAROSEGEL
ELEKTROPHORESE 35 2.10. PROTEINANFAERBUNG IN POLYACRYLAMIDGELEN 36
2.10.1. COOMASSIEFAERBUNG 36 2.10.2. SILBERFAERBUNG 36 2.11. ISOLIERUNG
DES SS-GALACTOSIDASE-FUSIONSPROTEINS 37 2.12. ISOLIERUNG VON DNA 37
2.12.1. ISOLIERUNG VON GESAMT-DNA 37 2.12.2. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA
38 2.12.3. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 38 2.13.
ANALYSE VON DNA 40 2.13.1. KONZENTRATIONSABSCHAETZUNG 40 2.13.2.
GROESSENBESTIMMUNG VON DNA-FRAGMENTEN 40 2.14. REINIGUNG UND
KONZENTRIERUNG VON DNA 40 2.14.1. PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 40
2.14.2. ETHANOL-PRAEZIPITATION 41 2.14.3. IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
41 2.15. AUFARBEITUNG VON DNA 41 2.15.1. VERDAUUNG VON DNA DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 41 2.15.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 41
2.15.3. HERSTELLUNG VON GLATTEN ENDEN 42 2.15.4. VERKUERZUNG VON
DNA-FRAGMENTEN MIT DER EXONUKLEASE SSFL/31 42 2.15.5. LIGIERUNG VON
DNA-FRAGMENTEN 43 2.16. UEBERTRAGUNG VON DNA 43 2.16.1. KONJUGATION 43
2.16.2. TRANSFORMATION VON E. COLI 44 2.16.3. TRANSDUKTION VON E. COLI
44 INHALTSVERZEICHNIS HI_ 2.17. MEMBRANGEBUNDENE
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNGEN 47 2.17.1. BIOTINYLIERUNG VON DNA 47 2.17.2.
VAKUUM-BLOTTING 47 2.17.3. DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG 48 2.17.4. NACHWEIS
BIOTINYLIERTERDNA 48 2.18. DNA-SEQUENZIERUNG 49 2.18.1. PRAEPARATION VON
PLASMID-DNA 49 2.18.2. SYNTHESE VON PRIMERN 50 2.18.3. PRIMER-ANLAGERUNG
( ANNEALING -REAKTION) 50 2.18.4. SEQUENZIER-REAKTION 51 2.18.5.
ELEKTROPHORESE UND AUTORADIOGRAPHIE 52 2.18.6. ANALYSE VON SEQUENZDATEN
53 2.19. ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE METHODEN 54 2.19.1 FIXIERUNG UND
EINBETTUNG 54 2.19.2. ULTRAMIKROTOMIE UND NACHKONTRASU ERUNG MIT
URANYLACETAT 54 2.19.3. ELEKTRONENMIKROSKOPIE 55 2.20. CHEMIKALIEN,
BIOCHEMIKALIEN UND ENZYME 55 3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 57 3.1. STAND
DER VORARBEITEN MIT DEN PHA-LEAKY MUTANTEN VON A. EUTROPHUS 57 3.2.
PHAENO- UND GENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PHA-LEAKY MUTANTEN DER
UNTERKLASSE A 58 3.2.1. WACHSTUMS-UND SPEICHERVERHALTEN 58 3.2.2.
ANALYSE DES MOLEKULARGEWICHTS DES POLYMERS AUS PHA-LEAKY MUTANTEN DER
UNTERKLASSE A 59 3.2.3. KLONIERUNG DES VOLLSTAENDIGEN PHAHI-GENOFTES 62
3.2.4. SEQUENZIERUNG DES PHAHI-GCNORTES MIT FLANKIERENDEN BEREICHEN UND
ANALYSE DER SEQUENZDATEN 65 3.2.5. DAS PHAL-GCN UND DESSEN GENPRODUKT,
DAS PROTEIN I 70 3.2.6. DAS PHAH-GEN UND DESSEN GENPRODUKT, DAS PROTEIN
H 73 3.2.7. TRANSLATIONSSTARTBESTIMMUNG DES PHAH-GENS 76 3.2.8.
BESTIMMUNG DER TRANSPOSON-INSERTIONEN IN DEN GENEN PHAHL 78 3.2.9.
ANALYSE DES ORF4 UND DES BFR-GENS 78 3.2.10. KOMPLEMENTATIONSVERSUCHE
VON PTS MUTANTEN VON E. COLI 80 INHALTSVERZEICHNIS IV_ 3.3. ISOLIERUNG
UND CHARAKTERISIERUNG VON SEKUNDAERMUTANTEN VON PHA-LEAKY MUTANTEN DER
UNTERKLASSE A 8 1 3.3.1. ISOLIERUNG VON TN5-INDUZIERTEN SEKUNDAERMUTANTEN
VON PHA-LEAKY MUTANTEN 81 3.3.2. KLONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES
TN5-CORI-FRAGMENTES AUS SK 4411 83 3.3.3. KOMPLEMENTATIONSVERSUCH DER
SEKUNDAERMUTANTE SK4411 ZUM PHAENOTYP PHA-LEAKY 84 3.3.4. PARTIELLE
SEQUENZIERUNG DES TN5-ECORI-FRAGMENTES AUS SK 4411 85 3.4. PHAENO- UND
GENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PHA-LEAKY MUTANTEN DER UNTERKLASSE B
87 3.4.1. WACHSTUMS-UND SPEICHERVERHALTEN 87 3.4.2. KLONIERUNG DES
PHAL-GENS 89 3.4.3. PARTIELLE SEQUENZIERUNG DES PHAL-GENS 89 3.4.4.
HETEROLOGE EXPRESSION DER DIHYDROLIPOAMID-DEHYDROGENASE AUS/4, EUTROPHUS
IN E. COLI 91 3.4.5. HYBRIDISIERUNGEN MIT EINER
DIHYDROLIPOAMID-DEHYDROGENASE SPEZIFISCHEN SONDE 92 3.5. PHAENO- UND
GENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PHA-LEAKY MUTANTEN DER UNTERKLASSE C
94 3.5.1. WACHSTUMS-UND SPEICHERVERHALTEN 94 3.5.2.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ABBILDUNGEN 97 3.5.3. ISOLIERUNG NATIVER
PHA-GRANULA UND ANREICHERUNG EINES GRANULUM-ASSOZIIERTEN PROTEINS 99
3.5.4. KLONIERUNG DES P/IA^T-GENORTES 103 3.5.5.
KOMPLEMENTAUE ONSVERSUCHE MIT DEN FRAGMENTEN E5000UNDE1900 107 3.5.6.
KLONIERUNG DER TN5-MARKIERTEN FRAGMENTE UND LOKALISIERUNG DES
TRANSPOSONS 108 3.5.7. SEQUENZIERUNG DES PAARAEF-GENORTES UND ANALYSE DER
SEQUENZDATEN 114 3.5.8. DAS GENPRODUKT DES PHAK-GENS 118 3.5.9.
SEQUENZIERUNG DES FRAGMENTES E1900 UND ANALYSE DER SEQUENZDATEN 118
3.5.10. TRANSPOSON-INSERTION IN DER MUTANTE H2262 122 INHALTSVERZEICHNIS
3.6. CODONVERWENDUNG DER IDENTIFIZIERTEN GENE 124 4. DISKUSSION 127 4.1.
KLONIERUNG VON FUER DEN PHAENOTYP PHA-LEAKY RELEVANTEN GENORTEN 127 4.2.
MODELL ZUR REGULATION DES INTRAZELLULAEREN PHA-ABBAUS 129 4.3. DER
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX, EIN FLASCHENHALS ZUR MAXIMALEN
PHA-AKKUMULATION 135 4.4. DER EINFLUSS VON PHA-GRANULA ASSOZIIERTEN
PROTEINEN AUF MAXIMALE PHA-AKKUMULATION 138 4.5. DAS FRAGMENT EL900
KOMPLEMENTIERT PARTIELL PHA-LEAKY MUTANTEN DER UNTERKLASSEN A UND C 144
4.6. BACTERIOFERRITIN (BFR), EIN EISEN-BINDENDES HAEMOPROTEIN IN
BAKTERIEN 146 5. ZUSAMMENFASSUNG 148 6. LITERATURVERZEICHNIS 151
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