Untersuchungen an Proteasomen, hochmolekularen Proteinasen, aus Dictyostelium discoideum mit Hilfe monoklonaler Antikörper:
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1993
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
1
EINLEITUNG
2
1.1
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
2
1.2
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
4
1.3
PROTEASOMEN
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
MATERIAL
9
2.1.1
ENZYME,
ANTIKOERPER,
INHIBITOREN
UND
ANTIBIOTIKA
9
2.1.2
FLUORESZENZFARBSTOFFE
10
2.1.3
SAEULENMATERIALIEN
10
2.1.4
REAGENZIEN
10
2.1.5
MEDIEN
12
2.1.5.1
MEDIEN
FUER
DIE
D.- FISCOAETEWN-KULTUR
13
2.1.5.2
MEDIEN
FUER
DIE
KULTUR
VON
E.
COLI
13
2.1.6
PUFFER
UND
ANDERE
LOESUNGEN
14
2.1.7
BAKTERIENSTAEMME
15
2.1.8
VEKTOREN
16
2.1.9
RADIOCHEMIKALIEN
16
2.1.10
GERAETE
16
2.1.11
SONSTIGE
MATERIALIEN
18
2.2
KULTUR
VON
D.
DISCOIDEUM
18
2.2.1
VERWENDETE
D.
-DISCOIDEUM-STAEMME
18
2.2.2
ANZUCHT
IN
SUSPENSION
19
2.2.2.1
SCHUETTELKULTUR
UNTER
NORMALBEDINGUNGEN
19
2.2.22
ENTWICKLUNG
IN
SUSPENSIONSKULTUR
19
2.2.2.3
SYNCHRONISATION
VON
D.-DISCOIDEUM-TJCWCN
20
2.2.3
ANZUCHT
AUF
AGARPLATTEN
20
22.3.1
SM
AGARPLATTEN
MIT
KLEBSIELLA
AEROGENES
20
2.2.3.2
SM-AGARPLATTEN
MIT
MICROCOCCUS
LUTEUS
20
2.2.4
KONSERVIERUNG
VON
D.
-DISCOIDEUM-SPOTTN
21
2.3
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
21
2.3.1
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
21
2.3.2
AUFREINIGUNG
VON
IGG
AUS
HYBRIDOMAKULTURUEBERSTAENDEN
25
2.3.3
OUCHTERLONY-GELDIFFUSIONSTEST
26
2.3.4
IMMUNFLUORESZENZ
AN
FIXIERTEN
D.
-DISCOIDEUM-ZEUEEN
27
2.3.4.1
FIXIERUNG
UND
MARKIERUNG
DER
ZELLEN
27
2.3.4.2
KONFOKALE
MIKROSKOPIE
28
2.3.5
KOPPLUNG
VON
FLUORESZENZFARBSTOFFEN
AN
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
29
2.4
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
29
2.4.1
SDS-PAGE
UND
"WESTENT'-TRANSFER
29
2.4.2
2D-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UND
"WESTEM"-TRANSFER
30
2.4.3
IMMUNMARKIERUNG
32
2.4.4
PROTEINFAERBUNG
MIT
COOMASSIE-BLAU
33
2.4.5
REINIGUNG
UND
N-TERMINALE
SEQUENZIERUNG
DES
34
KDA-PROTEINS
AUS
DER
UNLOESLICHEN
ZELLFRAKTION
VON
D.
DISCOIDEUM
33
2.4.6
AUFREINIGUNG
VON
PROTEASOMEN
AUS
D.
DISCOIDEUM
35
2.4.7
PRAEPARATION
VON
KERNEN
DURCH
DIFFERENTIELLE
ZENTRIFUGATION
37
2.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
37
2.5.1
SCREENING
VON
XGTLL-CDNA-BANKEN
37
2.5.2
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
39
2.5.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
40
2.5.3.1
"MINI"-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
40
2.5.3.2
GEWINNUNG
VON
PLASMID-DNA
MIT
DER
QUIAGEN-METHODE
41
2.5.4
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
42
2.5.5
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
43
2.5.5.1
VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
43
2.5.5.2
DNA-LIGASE-REAKTION
43
2.5.5.3
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
43
2.5.5.4
UEBERFUEHRUNG
5-UEBERSTEHENDER
ENDEN
IN
GLATTE
ENDEN
44
2.5.6
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
44
2.5.7
SOUTHERN-BLOT
45
2.5.8
DNA-FRAGMENTISOLIERUNG
AUS
AGAROSE-GELEN
46
2.5.8.1
FRAGMENTISOLIERUNG
MIT
DE-81-IONENAUSTAUSCHPAPIER
46
2.5.8.2
FRAGMENTISOLIERUNG
MIT
"GLASMILCH"
46
2.5.9
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
D.
DISCOIDEUM
47
2.5.10
RNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
UND
NORTHERN
BLOT
47
2.5.11
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-PROBEN
DURCH
"NICK-TRANSLATION"
48
2.5.12
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
PROBEN
49
2.5.13
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
50
2.5.13.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
NACH
DER
MEHR-IONEN-TECHNIK
50
2.5.13.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
FUER
DIE
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
51
2.5.13.3
TRANSFORMATION
DURCH
HITZESCHOCK
51
2.5.13.4
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
51
2.5.13.5
KONSERVIERUNG
VON
E-CO/Z-KULTUREN
52
2.5.14
TRANSFORMATION
VON
D.
DISCOIDEUM
52
2.5.14.1
TRANSFORMATION
NACH
DER
CALCIUM-PHOSPHAT-METHODE
52
2.5.14.2
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
54
2.5.15
OLIGONUKLEOTIDE
55
2.5.16
"POLYMERASE-CHAIN"-REAKTION
(PCR)
56
2.5.17
EXPRESSION
DER
PROTEASOMEN-UNTEREINHEIT
DD4
IN
E.
COLI
58
2.5.18
PLASMID-DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCH-METHODE
58
2.5.19
COMPUTERPROGRAMME
FUER
DIE
SEQUENZANALYSE
UND
DATENDARSTELLUNG
61
3
DAS
34
KDA-PROTEIN
IST
EINE
UNTEREINHEIT
DER
MITOCHONDRIALEN
PYRUVATDEHYDROGENASE
62
3.1
ERGEBNISSE
62
3.1.1
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
AUS
DEN
FUSIONEN
158
UND
159
62
3.1.2
PARTIELLE
REINIGUNG
DES
34
KDA-PROTEINS
AUS
DER
UNLOESLICHEN
ZELLFRAKTION
VON
D.
DISCOIDEUM
63
3.1.3
DAS
34
KDA-PROTEIN
ZEIGT
HOMOLOGIE
ZU
DER
SS-UNTEREINHEIT
DER
MITOCHONDRIALEN
PYRUVATDEHYDROGENASE
68
3.1.4
IMMUNMARKIERUNG
VON
DICTYOSTELIUM-ZELLEN
MIT
MAK
183
68
3.2
DISKUSSION
70
4
PROTEASOMENIN
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
74
4.1
ERGEBNISSE
74
4.1.1
AUFREINIGUNG
VON
PROTEASOMEN
AUS
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
74
4.1.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEASOMEN
VON
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
TI
4.1.3
LOKALISATION
DER
PROTEASOMEN
IN
FIXIERTEN
D.
-DISCOIDEUM-ZELLEN
80
4.1.4
NACHWEIS
DER
PROTEASOMEN
IN
ISOLIERTEN
DICTYOSTELIUM-KEMEN
85
4.1.5
N-TERMINALE
SEQUENZANALYSE
DER
PROTEASOMEN-UNTEREINHEITEN
86
4.1.6
DIE
PROTEASOMEN-UNTEREINHEIT
DD4
87
4.1.6.1
ISOLIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
DER
PROTEASOMEN-UNTEREINHEIT
DD4
87
4.1.6.2
SEQUENZIERUNG
UND
ORGANISATION
DES
DD4-CDNA-KLONS
K3-3
88
4.1.6.3
DAS
DD4-GENPRODUKT
ZEIGT
HOMOLOGIEN
ZU
A-AEHNLICHEN
PROTEASOMEN-UNTEREINHEITEN
90
4.1.6.4
DAS
DD4-GEN
IST
EIN
"SINGLE
COPY"-GEN
92
4.1.6.5
EXPRESSION
VON
DD4
IN
E.
COLI
93
4.1.6.6
VERSUCHE
ZUR
INAKTIVIERUNG
DES
DD4-GENS
DURCH
HOMOLOGE
REKOMBINATION
94
4.1.7
DIE
PROTEASOMEN-UNTEREINHEIT
DD5
96
4.1.7.1
ISOLIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
DER
PROTEASOMEN-UNTEREINHEIT
DD5
96
4.1.7.2
SEQUENZIERUNG
UND
STRUKTUR
DES
DD5-CDNA-KLONS
L7-1
96
4.1.7.3
DAS
DD5-GENPRODUKT
ZEIGT
HOMOLOGIEN
ZU
A-AEHNLICHEN
PROTEASOMEN-UNTEREINHEITEN
99
4.1.7.4
ORGANISATION
DES
DD5-GENS
IM
GENOM
VON
D.
DISCOIDEUM
102
4.1.8
ENTWICKLUNGSREGULATION
DER
PROTEASOMEN
UNTEREINHEITEN
DD4
UND
DD5
103
4.2
DISKUSSION
105
4.2.1
AUFREINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEASOMEN
AUS
D.
DISCOIDEUM
105
4.2.2
PRIMAERSTRUKTUREN
DER
PROTEASOMEN-UNTEREINHEITEN
107
4.2.3
SUBZELLULAERE
LOKALISATION
DER
PROTEASOMEN
IN
DICTYOSTELIUM
111
4.2.4
ENTWICKLUNGSREGULATION
DER
PROTEASOMEN
113
4.2.5
GENETISCHE
VERSUCHE
MIT
DEM
ZIELE
DER
FUNKTIONSAUFKLAERUNG
114
5
ZUSAMMENFASSUNG
118
6
LITERATUR
120
DANKSAGUNGEN
135
LEBENSLAUF
136 |
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