Import, Sortierung und Assemblierung nukleär kodierter Proteine der Thylakoidmembran:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1993
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4
IMPORT, SORTIERUNG UND ASSEMBLIERUNG NUKLEAR KODIERTER PROTEINE DER
THYLAKOIDMEMBRAN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER BIOLOGIE
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORGELEGT VON
DAGUANG CAI
AUS YANGZHOU, VR CHINA
1993
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN 4
1. ZUSAMMENFASSUNG 7
2. EINLEITUNG 11
3. MATERIAL UND METHODEN 20
3.1.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 20
3.1.2 BAKTERIEN UND VEKTOREN 20
3.1.3 PFLANZENMATERIAL 20
3.2 KLONIERUNG IN E. COLI 21
3.2.1 LIGATION VON DNA 21
3.2.2 TRANSFORMATION 21
3.2.3 SELEKTION 21
3.2.4 KOLONIETRANSFER UND HYBRIDISIERUNG 21
3.3 ISOLATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 22
3.3.1 ISOLATION VON PLASMID-DNA NACH HOLMES UND QUIGLEY (1981) 22 3.3.2
ISOLATION VON PLASMW-DNA NACH BIRNBOIM UND DOLY (1979) 23 3.4
SEQUENZIERUNG VON DNA 24
3.4.1 SEQUENZIERUNG VON DNA MIT DER SEQUENASE-TM 24
3.4.2 SEQUENZGELELEKTROPHORESE 25
3.5 OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE UND -AUFREINIGUNG 26
3.6 GEZIELTE MUTAGENESE MIT DEM GDDNA-SYSTEM 26
3.6.1 DURCHFUEHRUNG DER MUTAGENESE 27
3.6.2 HANDHABUNG DES M13-PHAGEN 29
3.7 GELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 29
3.7.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 29
3.7.2 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE MIT HORIZONTALEN HARNSTOFF
GRADIENTEN 31
3.7.3 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN (SOG.
GRUENE GELE ) 31
3.7.4 2D -GELELEKTROPHORESE 32
3.7.5 FLUOROGRAPHIE VON POLYACRYLAMIDGELEN 33
3.7.6 RADIOSEQUENZIERUNG VON PROTEINEN 33
3.7.6.1 TRANSFER VON PROTEINEN AUF GLASSYBOND -MEMBRAN 33
3.7.6.2 BESTIMMUNG DER RADIOAKTIVITAET EINZELNER AMINOSAEUREN 34 3.8
ERSTELLUNG DER GENKASSETTEN 34
3.8.1 ERSTELLUNG DER GENKASSETTEN MIT HILFE VON OLIGONUKLEOTID-
ADAPTOREN 34
3.8.1.1 HERSTELLUNG DER ADAPTOREN FUER KASSETTEN 34
3.8.1.2 GEWINNUNG DER CDNA-FRAGMENTE VON TRANSITPEPTIDEN UND REIFEN
PROTEINEN 35
IMAGE 3
3.8.2 HERSTELLUNG VON GENKASSETTEN DURCH PCR 35
3.8.2.1 AMPLIFIZIERUNG DES FRAGMENTS FUER DAS REIFE PROTEIN DER
UNTEREINHEIT 3 DER PHOTOSYSTEMS I (PSI-3) 36
3.8.2.2 KLONIERUNG DER AMPLIFIZIERTEN FRAGMENTE 36
3.9 IMPORT VON PROTEINEN IN ISOLIERTE CHLOROPLASTEN UND THYLAKOIDE 37
3.9.1 IN WF/O-TRANSKRIPTION 37
3.9.3 IN V/FRO-TRANSLATION 38
3.9.4 IMPORT VON IN VITRO SYNTHETISIERTEN PROTEINEN IN INTAKTE
CHLOROPLASTEN {IN ORGANELLO-ANSATZ) 39
3.9.5 TRENNUNG VON PSL- UND PSII-KOMPLEXEN 42
3.9.6 TRANSLOKATION VON IN VITRO SYNTHETISIERTEN PROTEINEN IN ISOLIERTE
THYLAKOIDE [IN THYLAKOIDO-ANSATZ) 43
3.9.6.1 ISOLIERUNG DER STROMA- UND THYLAKOIDFRAKTIONEN 43
3.9.6.2 IMPORTREAKTION 44
3.9.6.3 IN VITRO PROZESSIERUNGSEXPERIMENTE MIT ISOLIERTEN STROMA- UND
THYLAKOID-PROZESSIERUNGSPEPTIDASEN 45
4. ERGEBNISSE 46
4.1 IMPORT, INNERPLASTIDAERE SORTIERUNG UND ASSEMBLIERUNG DES
AUTHENTISCHEN VORLAEUFERS FUER DAS 20 KDA-APOPROTEIN DES CP24-KOMPLEXES
VON PSII 46
4.1.1 THEORETISCHE ANALYSE DES 20 KDA-VORLAEUFERPROTEINS 47
4.1.2 HERSTELLUNG DER GENKASSETTEN FUER DAS 20 KDA-PROTEIN UND
KONSTRUKTION VON CHIMAEREN VORLAEUFERPROTEINEN 49
4.1.3 DAS TRANSITPEPTID DES 20 KDA-PROTEINS IST EIN INS STROMA
DIRIGIERENDES SIGNAL 51
4.1.4 DIE 11 N-TERMINALEN AMINOSAEURERESTE DES. REIFEN 20 KD- PROTEINS
HABEN EINEN POSITIVEN EINFLUSS NUR AUF DIE REINEN IMPORTEIGENSCHAFTEN DES
TRANSITPEPTIDS 53
4.1.5 DIE INTEGRATION DES 20 KDA-PROTEINS IN DIE THYLAKOIDMEMBRAN KANN
UNABHAENGIG VOM TRANSITPEPTID ERFOLGEN 55
4.1.6 IMPORT DES REIFEN 20 KDA-PROTEINS MITTELS THYLAKOID-DIRIGIERENDER
TRANSITPEPTIDE 57
4.1.7 DIE ASSEMBLIERUNG DES 20 KDA-PROTEINS IN DEN CP24-KOMPLEX VON PSII
KANN UNABHAENGIG VOM TRANSITPEPTID ERFOLGEN 57 4.1.8 DIE VERSCHIEBUNG DES
20 KDA-PROTEINS INNERHALB DER THYLAKOIDMEMBRAN 60
4.2 IMPORT UND INNERPLASTIDAERE SORTIERUNG DER UNTEREINHEIT 3 VON
PHOTOSYSTEM I (PSI-3) 63
4.2.1 DAS TRANSITPEPTID DES PSI-3 VORLAEUFERPROTEINS HAT THYLAKOID-
DIRIGIERENDE EIGENSCHAFTEN 64
4.2.2 DAS REIFE PSI-3 POLYPEPTID KANN NICHT SELBSTAENDIG IN DIE
THYLAKOIDMEMBRAN INTEGRIEREN 66
4.3 ANALYSE VON EPITOPEN IN VORLAEUFERPOLYPEPTIDEN FUER EINZELNE
TEILSCHRITTE DES TRANSLOKATIONSPROZESSES 67
IMAGE 4
4.3.1 INTERMEDIAERE PROZESSIERUNG VON THYLAKOID-DIRIGIERENDEN
TRANSITPEPTIDEN 68
4.3.1.1 DIE BESTIMMUNG DER INTERMEDIATSCHNITTSTELLEN IN THYLAKOID-
DIRIGIERENDEN TRANSITPEPTIDEN 71
4.3.1.2 DER BEREICH DER PROZESSIERUNGSSTELLE IM TRANSITPEPTID DES 23
KDA-PROTEINS IST GLEICHZEITIG AUCH DAS ERKENNUNGSSIGNAL FUER DIE PROTEASE
74
4.3.2 ANALYSE DER TERMINALEN PROZESSIERUNG VON THYLAKOID-DIRIGIERENDEN
TRANSITPEPTIDEN 76
4.3.2.1 DIE NEGATIVE LADUNG IN POSITION + 2 DES REIFEN PLASTOCYANINS HAT
KEINEN EINFLUSS AUF DIE TERMINALE PROZESSIERUNG DES VORLAEUFERMOLEKUELS 76
4.3.2.2 DAS REIFE PLASTOCYANIN ALS TRAEGERPROTEIN FUER ZUSAETZLICHE
PROZESSIERUNGSEPITOPE 77
4.3.2.3 ADDITION VON VERMUTETEN THYLAKOIDPROZESSIERUNGSEPITOPEN IN DEN
REIFEN TEIL DES PLASTOCYANIN-VORLAEUFERMOLEKUELS 78
4.3.2.4 SUBSTITUTION VON TEILEN DES REIFEN PLASTOCYANINS DURCH C2-MOTIVE
AUS THYLAKOID-DIRIGIERENDEN TRANSITPEPTIDEN 80
4.4 EINFLUSS VON PHYSIOLOGISCHEN FAKTOREN AUF DEN TRANSFER VON LUMINALEN
PROTEINEN UEBER DIE THYLAKOIDMEMBRAN 82
5. DISKUSSION 85
6. LITERATURVERZEICHNIS 93
7. DANKSAGUNG 110
8. LEBENSLAUF 111
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