Identifikation und Charakterisierung von SPSF I und SPSF II: zwei neue zelluläre, spezifisch Einzelstrang-DNA-bindende Faktoren und ihre Wechselwirkung mit replikationsaktiven Regionen von BPV-1
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1992
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-I-
INHALTSVERZEICHNIS
I
NHALTSVERZEICHNIS
1.
E
INLEITUNG
1-13
1.1.
DIE
PAPILLOMAVIREN
1
1.2.
DAS
MODELLSYSTEM
BPV-1
2
1.3.
DIE
TRANSFORMIERENDEN
FUNKTIONEN
DER
PAPILLOMAVIREN
4
1.4.
DIE
REPLIKATIONSMECHANISEN
DER
PAPILLOMAVIREN
IN
DEN
EINZELNEN
PHASEN
DES
INFEKTIONSZYKLUS
6
1.5.
DER
REPLIKATIONSSTARTPUNKT
VON
BPV-1
7
1.6.
DIE
VIRALEN
REPLIKATIONSPROTEINE
EL
UND
E2
10
1.7.
ZELLULAERE
PROTEINE,
DIE
AN
DER
VIRUS-REPLIKATION
BETEILIGT
SIND
12
1.8.
AUFGABENSTELLUNG
13
2.
M
ATERIAL
14-18
2.1.
ZELLINIEN
14
2.2.
BAKTERIENSTAEMME
14
2.3.
PLASMIDE
15
2.4.
ENZYME
15
2.5.
CHEMIKALIEN,
GERAETE
UND
ANDERE
MATERIALIEN
16
2.6.
SYNTHETISCHE
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
18
3.
M
ETHODEN
19-49
3.1.
BAKTERIENKULTUREN
19
3.1.1.
VERMEHRUNG
VON
BAKTERIEN
PLATTENKULTUR
FLUESSIGKULTUR
19
3.1.2.
AUFBEWAHRUNG
VON
BAKTERIEN
19
INHALTSVERZEICHNIS
-II
3.2.
KLONIEREN
IN
BAKTERIEN
20
3.2.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
20
3.2.2.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
20
3.3.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
E.COLI
20
3.3.1.
ALKALISCHER
SCHNELLAUFSCHLUSS
FUER
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
20
3.3.2.
PLASMIDREINIGUNG
DURCH
ALKALISCHEN
AUFSCHLUSS
UND
QIAGEN
ANIONENAUSTAUSCHER
CHROMATOGRAPHIE
21
3.3.3.
PLASMIDREINIGUNG
DURCH
TRITONAUFSCHLUSS
UND
CSCL-DICHTEGRADIENTEN
22
ZENTRIFUGATION
3.4.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
23
3.4.1.
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
23
3.4.2.
ETHANOLFALLUNG
23
3.4.3.
REINIGUNG
DURCH
GELFILTRATION
23
3.5.
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
24
3.6.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
UND
DEREN
ISOLIERUNG
AUSAGAROSEGELEN
25
3.6.1.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA
25
3.6.2.
ISOLIERUNG
VON DNA-FRAGMENTEN
NACH
DER
"FREEZE/THAW"
METHODE
(BENSON,
1984)
25
3.6.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
NIEDRIGSCHMELZENDER
AGAROSE
(WIESLANDER,
1979)
26
3.6.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
AUSZENTRIFUGIEREN
26
3.7.
VERFAHREN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
SPEZIFISCHER
DNA-MOLEKUELE
26
3.7.1.
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NITROCELLULOSEFILTER
(SOUTHERN,
1975)
26
3.7.2.
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
DNA
27
-IN
INHALTSVERZEICHNIS
3.8.
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
AN
DNA
28
3.8.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
28
3.8.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-ENDEN
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
28
3.8.3.
ABSPALTEN
UEBERHAENGENDER
3'-ENDEN
MIT
T4-DNA
POLYMERASE
28
3.8.4.
AUFFUELLEN
VON
5'-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
MIT
KLENOW-POLYMERASE
29
3.8.5.
KOVALENTE
VERKNUEPFUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
29
3.9.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
UND
RNA
30
3.9.1.
5'-MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
FY^PJ-ATP
30
3.9.2.
32
P-MARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA-FRAGMENTE
DURCH
AUFFULLEN
3'-ZURUECKGESETZTER
ENDEN
MIT
KLENOW-POLYMERASE
30
3.9.3.
32
P-MARKIERUNG
DURCH
HEXAMERE
OLIGONUKLEOTIDE
UND
KLENOW-POLYMERASE
(RANDOM
PRIME
KIT;
NACH
FEINBERG
UND
VOGELSTEIN,
1983)
30
3.9.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
RNA
DURCH
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
31
3.9.5.
CERENKOV-MESSUNG
32
P-MARKIERTER
DNA
(BERGER,
1987)
31
3.10.
KOPPLUNG
VON
DNA
AN
BROMCYAN-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
FUER
DIE
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
31
3.11.
KULTIVIERUNG
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
32
3.11.1.
ZELLKULTUR
32
EINSCHICHTKULTUREN
SUSPENSIONSKULTUREN
AUFBEWAHRUNG
VON
ZELLINIEN
3.11.2.
TRANSFEKTION
EUKRAYONTISCHER
ZELLEN
MIT
DER
CALCIUM-PHOSPHAT-METHODE
33
3.11.3.
PRAEPARATION
NIEDERMOLEKULARER
DNA
AUS
TRANSFIZIERTEN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
(HIRT,
1967)
34
3.11.4.
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
TRANSFIZIERTEN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
35
3.11.5.
PRAEPARATION
VON
CYTOPLASMA
UND
KEMEXTRAKTEN
(MODIFIZIERT
NACH
DIGNAM
ET
AL.,
1983)
35
3.12.
ANREICHERUNG
VON
SPSF
AUS
C127
ODER
CB1
ZELLEN
37
3.12.1.
CM-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
(KATIONENAUSTAUSCHER)
37
3.12.2.
DEAE-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
(ANIONENAUSTAUSCHER)
37
INHALTSVERZEICHNIS
-IV
3.13.
REINIGUNG
DER
SPEZIFISCHEN
SSDNA-BINDENDEN
FAKTOREN
SPSF
I
UND
II
AUS
KALBSTHYMUS
37
3.13.1.
GEWEBEAUFSCHLUSS
UND
CM-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
37
3.13.2.
DEAE-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
38
3.13.3.
MONOQ-CHROMATOGRAPHIE
39
3.13.4.
SPEZIFISCHE
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
39
3.14.
CHARAKTERISIERUNG
VON
PROTEINEN
40
3.14.1.
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTES
IN
LOESUNGEN
NACH
BIO-RAD
40
3.14.2.
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
IN
DENATURIERENDEN
SDS-GELEN
(LAEMMLI,
1970)
40
3.14.3.
ANFAERBEN
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
41
COOMASSIE-FAERBUNG
SILBERFAERBUNG
3.15.
RENATURIERUNG
VON
PROTEINEN
AUS
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
42
3.16.
ANALYSE
VON
PROTEIN/DNA-KOMPLEXEN
(NACH
FRIED
AND
CROTHERS,
1981)
43
3.16.1.
GELRETENTION
43
3.16.2.
METHYLIERUNGSINTERFERENZ-EXPERIMENT
44
3.16.3.
T4
DNA-POLYMERASE
FOOTPRINT
EXPERIMENT
46
3.16.4.
UV-CROSSLINKING
EXPERIMENT
47
3.17.
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET
REKOMBINANTER
PLASMIDE
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
47
3.17.1.
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
DURCH
ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
47
3.17.2.
CAT-AKTIVITAETSTEST
48
3.17.3.
LUCIFERASE-AKTIVITAETSTEST
48
3.18.
UNTERSUCHUNG
VON
DNA-SEKUNDAERSTRUKTUREN
MIT
ENDONUKLEASE
VII
49
-V
INHALTSVERZEICHNIS
3.19.
ANALYSE
VON
RNA/PROTEIN-KOMPLEXEN
49
4.
E
RGEBNISSE
50-120
4.1.
DARSTELLUNG
DER
VERWENDETEN
DNA-FRAGMENTE
UND
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDE
AUS
DER
"LONG
CONTROL
REGION
(LCR)"
VON
BPV-1
50
4.2.
IDENTIFIKATION
ZELLULAERER
PROTEINE,
DIE
SPEZIFISCH
MIT
DNA
SEQUENZEN
AUS
DEM
LCR-BEREICH
VON
BPV-1
WECHSELWIRKEN
51
4.2.1.
SPEZIFISCHE
INTERAKTION
DER
SPSF
MIT
VERSCHIEDENEN
DNA-REGIONEN
51
4.2.1.1.
WECHSELWIRKUNG
DER
SPSF
MIT
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
AUS
PMS1/D1
51
4.2.1.2.
WECHSELWIRKUNG
DER
SPSF
MIT
DNA-FRAGMENTEN,
DIE
DIE
PMS
1/D1-REGION
ENTHALTEN
62
4.2.1.3
WECHSELWIRKUNG
DER
SPSF
MIT
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
AUS
DEM
REPLIKATIONSURSPRUNG
VON
BPV
1
66
4.3.
WECHSELWIRKUNG
DER
SPSF
MIT
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
AUS
DEM
P2
PROMOTOR
DES
C-MYC
GENS
70
4.4.
NACHWEIS
DER
HOHEN
SPEZIFITAET
DER
SPSF-INTERAKTIONEN
MIT
DEN
DREI
UNTERSCHIEDLICHEN
DNA-REGIONEN
AUS
DEM
PMSL/DL-BEREICH
VON
BPV-1,
AUS
DEM
BPV-L-ORIGIN
UND
AUS
DEM
C-MYC
P2
PROMOTOR
73
4.5.
DIE
EXPRESSION
VIRALER
PROTEINE
BEINFLUSST
NICHT
DIE
KOMPLEXBILDUNG
DER
ZELLULAEREN
SPS-FAKTOREN
-
VERGLEICH
EINER
BPV-1
TRANSFORMIERTEN
C127
MAUSZELLINIE
UND
EINER
NICHT
TRANSFIZIERTEN
C127
MAUSZELLINIE
78
4.6.
VORKOMMEN
DER
SPSF
IN
ZELLEXTRAKTEN
HOEHERER
EUKARYONTEN
80
-VI-
INHALTSVERZEICHNIS
4.7.
LOKALISATION
DER
KONTAKTPUNKTE
ZWISCHEN
SPS-FAKTOREN
UND
GEBUNDENEN
DNA-REGIONEN
82
4.7.1.
ANALYSE
DER
KONTAKTPUNKTE
DER
SPSF
IN
DER
PMSL/DL-REGION
VON
BPV-1
DURCH
METHYLIERUNGSINTERFERENZ
UND
T4
DNA-POLYMERASE
FOOTPRINT
82
4.7.2.
ANALYSE
DER
KONTAKTPUNKTE
DER
SPSF
IM
URSPRUNGSPUNKT
DER
REPLIKATION
VON
BPV-1
91
4.7.3.
ANALYSE
DER
KONTAKTPUNKTE
DER
SPSF
IM
P2
PROMOTOR
DES
C-MYC-GENS
91
4.8.
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
SPSF
94
4.8.1.
ANREICHERUNG
VON
SPSF
AUS
C127
FIBROBLASTEN-KULTURZELLEN
94
4.8.1.1.
HERSTELLUNG
VON
CYTOPLASMA
UND
KEMEXTRAKTEN
AUS
C127
ZELLEN
94
4.8.1.2.
CM-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
94
4.8.1.3.
DEAE-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
95
4.8.2.
REINIGUNG
VON
SPSF
AUS
KALBSTHYMUS
97
4.8.2.1.
GEWEBEAUFSCHLUSS,
CM-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
UND
DEAE-SEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
97
4.8.2.2.
MONOQ-CHROMATOGRAPHIE
98
4.8.2.3.
TRENNUNG
ZWEIER
SPEZIFISCH
SSDNA-BINDENDER
FAKTOREN,
SPSF
I
UND
SPSF
II,
DURCH
DNA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
99
4.8.2.4.
QUALITATIVE
ANALYSE
DER
EINZELNEN
REINIGUNGSSTUFEN
DURCH
SDS-GELELEKTROPHORESE
102
4.8.2.5.
QUANTITATIVE
ANALYSE
DER
PROTEINREINIGUNG
102
4.9.
NACHWEIS
DER
BINDESPEZIFITAET
VON
SPSF
I
UND
II
104
4.9.1.
UV-CROSSLINKING
EXPERIMENT
104
4.9.2.
RENATURIERUNG
VON
SPSF
I
UND
II
AUS
DENATURIERENDEN
SDS-GELEN
108
4.10.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SPSF
I
UND
II/DNA-WECHSELWIRKUNG
110
4.10.1.
ABHAENGIGKEIT
DER
KOMPLEXBILDUNG
VON
DER
PROTEINKONZENTRATION
110
4.10.2.
INHIBITION
DER
DNA-BINDUNG
VON
SPSF
I
UND
II
DURCH
BESTIMMTE
NUKLEOSID-DI
UND
TRIPHOSPHATE
111
4.11.
AUSSCHLUSS
EINER
INTERAKTION
VON
SPSF
I
UND
II
MIT
IN
VITRO
TRANSKRIPTEN
DER
PMSL/DL-REGION
111
-VII
INHALTSVERZEICHNIS
4.12.
IDENTIFIKATION
STABILER
SEKUNDAERSTRUKTUREN
IN
SPSF-INTER
AGIERENDEN
DNA-BEREICHEN
DURCH
DAS
ENZYM
ENDONUKIEASE
VII
115
4.13.
AUSSCHLUSS
EINER
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERENDEN
FUNKTION
DES
DIE
PMSL/DL-REGION
ENTHALTENDEN
DNA-FRAGMENTES
DURCH
CAT-
ANALYSE
119
5.
D
ISKUSSION
121-131
5.1.
SPSF
I
UND
II:
ZWEI
VERSCHIEDENE
PROTEINE
ODER
EIN
PROTEIN
MIT
VERSCHIEDENEN
MODIFIKATIONEN?
123
5.2.
DIE
ROLLE
VON
SSDNA-BINDENDEN
PROTEINEN
IN
DER
REPLIKATION
UND
DER
TRANSKRIPTION
124
6.
Z
USAMMENFASSUNG
132-133
7.
L
ITERATURVERZEICHNIS
134-144
8.
A
NHANG
145-146
9.
V
ERZEICHNIS
DER
A
BKUERZUNGEN
147 |
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