Darstellung und Charakterisierung von mischfunktionellen Trägermaterialien für die HPLC-integrierte Probenaufbereitung von Adeninnucleotiden im Vollbluthämolysat:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1992
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| Beschreibung: | Paderborn, Univ.-Gesamthochsch., Diss., 1992 |
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| adam_text | Titel: Darstellung und Charakterisierung von mischfunktionellen Trägermaterialien für die HPLC-integriert
Autor: Marth, Petra
Jahr: 1992
INHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung und Aufgabenstellung 1
2 Stoffwechsel der Adeninnucleotide 7
2.1 De novo-Biosynthese der Purinnucleotide und ihre Regulation 7
2.1.1 Aufbau von Nucleotiden aus freien Basen ( Salvage Pathway ) 11
2.2 Katabolismus der Purinnucleotide 12
2.3 Aufgabe und Funktion der Nucleotide 14
2.4 Nucleotidstoffwechsel in Erythrozyten 17
2.5 Diagnostische Relevanz der Nucleotidbestimmung 20
2.6 Adeninnucleotidgehalte verschiedener biologischer Matrices 22
3 Methoden zur quantitativen Bestimmung der
Adeninnucleotide 23
3.1 Enzymatische Bestimmungsmethoden 23
3.2 Adeninnucleotid Analyse durch Hochleistungsflüssig¬
chromatographie 24
3.2.1 lonenaustauschchromatographie 25
3.2.2 Reversed-Phase lonenpaar-Chromatographie 25
3.3 Detektionsverfahren 26
3.3.1 UV-Detektion 26
3.3.2 Fluorimetrische Detektion 27
3.4 Methoden der Probenaufarbeitung 27
4 Chemische Modifizierung der Trägermaterialien 30
4.1 Aufbau und Eigenschaften des Fractogels-TSK 30
4.2 Immobilisierte Liganden 30
4.2.1 Affinftätsligandmeta-Aminophenylboronsäure 30
4.2.2 lonenaustauschliganden 32
4.2.3 Aminouracil 33
5 Synthese der modifizierten Trägermaterialien 34
5.1 Aktivierung der Fractogele 34
5.2 Darstellung der bifunktionellen Phasen 34
5.2.1 Immobilisierung primärer Amine 35
5.2.1.1 Immobilisierung des Affinitätsliganden meta-Aminophenyl-
boronsäure 35
5.2.1.2 Immobilisierung von 4-Aminobutylguanidin (Agmatin) 36
5.2.1.3 Immobilisierung von Spermidin bzw. Spermin 37
5.2.1.4 Immobilisierung von 5-Diethylamino-2-pentylamin [DEAPA] bzw.
Diethylaminoethylamin [DEAEA] 38
5.2.1.5 Immobilisierung des Kronenethers Diaza[2.2]-18-Krone-6 40
5.2.2 Immobilisierung von Diethylaminoethylchlorid [DEAECI] 41
5.3 Darstellung trifunktioneller Phasen 42
6 Charakterisierung der chemisch modifizierten
Trägermaterialien 45
6.1 Belegungsgrad 45
6.1.1 Belegungsgrad der Epoxy-Aktivierung 45
6.1.2 Belegungsgrad der immobilisierten meta-Aminophenyl-
boronsäure 46
6.1.3 Belegungsgrad der lonenaustauschliganden 47
6.1.4 Belegungsgrad der trifunktionellen Phase 48
6.2 Chromatographische Eigenschaften der modifizierten
Trägermaterialien 48
6.2.1 Bifunktionelle Trägermaterialien 48
6.2.1.1 Mit Agmatin modifizierte Aminophenylboronsäurephasen 51
6.2.1.2 Mit primären und sekundären Aminen modifizierte
Aminophenylboronsäurephasen 52
6.2.1.3 Mit tertiären Aminen modifizierte Aminophenyl¬
boronsäurephasen 53
6.2.1.4 Mit Kronenether modifizierte Aminophenylboronsäurephase 54
6.3.2 Trifunktionelles Trägermaterial 55
7 Entwicklung eines Zwei-Säulen HPLC-Analysen-
verfahrens zur Quantifizierung der AdenlnnucleotJde
im Vollbluthämolysat 61
7.1 HPLC-integrierte Probenaufarbeitung an mischfunktionellen Träger¬
materialien auf der Basis von Agmatin/Aminophenylboronsäure
substituierten Copoiymeren 61
7.2 Ausschlußchromatographische Eigenschaften der modifizerten
Fractogel Vorsäulen 62
7.3 Analysensystem 63
7.3.1 Apparativer Aufbau 63
7.3.2 Zusammensetzung der mobilen Phasen 65
7.3.3 Analysenprogramm 65
7.3.4 Analysenzyklus 67
7.3.4.1 Systeminterne Probenaufarbeitung 67
7.3.4.2 Transfer 68
7.3.4.3 Analytische Trennung 68
7.3.4.4 Rekonditionierung 68
7.3.5 Kalibrierung des Analysensystems 68
7.4 Probengewinnung und Probenvorbereitung 69
7.5 Probenstabilität 69
7.5.1 Stabilisierung der Vollbluthämolysat durch Zugabe von
Enzyminhibitoren 69
7.5.2 Lagerung der Vollblutproben bei Raumtemperatur 70
7.5.3 Inkubation der Vollblutproben mit Citrat-Phosphat-Dextrose (CPD) 74
7.5.4 Inkubation der CPD-Vollblutproben mit Adenin 78
7.6 Quantifizierung der Adeninnucleotide 81
7.7 Validierung des Analysensystems 83
8 Experimenteller Teil 97
8.1 Eingesetzte Geräte und Materialien 97
8.2 Aktivierung des Fractogels mit Epichlorhydrin 97
8.2.1 Quantitative Bestimmung der Epoxyaktivierung 98
8.3 Immobilisierung des Affinitätsliganden
meta-Aminophenylboronsäure 98
8.4 Darstellung der mit Agmatin-modifizierten
m-Aminophenylboronsäurephase 98
8.4.1 Umsetzung der m-Aminophenylboronsäurephase mit
4-Aminobutylguanidin (Agmatin) [Phase 1 ] 98
8.5 Darstellung der mit primären bzw. sekundären Aminen-modifizierten
m-Aminophenylboronsäurephase 99
8.5.1 Umsetzung einer m-Aminophenylboronsäurephase mit
1,12-Diamino-4,9-diazadodecan (Spermin) [Phase 4 ] 99
8.5.2 Umsetzung einer m-Aminophenylboronsäurephase mit
1,8-Diamino-4-azaoctan (Spermidin) [Phase 5 ] 99
8.6 Darstellung der mit tertiären Aminen-modifizierten
m-Aminophenylboronsäurephase 100
8.6.1 Umsetzung des epoxyaktivierten Fractogels mit
5-Diethylamino-2-pentylamin 100
8.6.2 Umsetzung des epoxyaktivierten Fractogels mit
2-Diethylaminoethylamin 100
8.6.3 Umsetzung einer m-Aminophenylboronsäurephase mit
2-Diethylaminoethylchlorid [Phase 9 ] 100
8.7 Darstellung der mit Kronenether-modifizierten
m-Aminophenylboronsäurephase 101
8.7.1 Umsetzung einer m-Aminophenylboronsäurephase mit
Diaza[2.2]-18-Krone-6 (Kryptofix22) [Phase 6 ] 101
8.8 Darstellung der trifunktionellen Phase 101
8.9 Enzymatischer Abbau der Adeninnucleotide im Vollbluthämolysat 101
8.9.1 Enzymatischer Abbau von ATP 101
8.9.2 Enzymatischer Abbau von ADP 102
8.9.3 Enzymatischer Abbau von AMP 102
8.10 Bakterienaufarbeitung 103
9 Zusammenfassung 104
10 Literaturverzeichnis 105
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