Die Regulation des Crassulaceen-Säurestoffwechsels: Untersuchungen zur Bedeutung der reversiblen Phosphorylierung der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase
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5
DIE REGULATION DES CRASSULACEEN-SAEURESTOFFWECHSELS: UNTERSUCHUNGEN ZUR
BEDEUTUNG DER REVERSIBLEN PHOSPHORYLIERUNG DER
PHOSPHOENOLPYRUVAT-CARBOXYLASE
VON DEM FACHBEREICH BIOLOGIE DER TECHNISCHEN HOCHSCHULE DARMSTADT
ZUR
ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES EINES
DOCTOR RERUM NATURALIUM (DR.RER.NAT.)
GENEHMIGTE DISSERTATION
VORGELEGT VON PETRA MAIER AUS HEIDELBERG
BERICHTERSTATTER: PROF. DR. M. KLUGE MITBERICHTERSTATTER: PROF. DR. U.
LUETTGE
TAG DER EINREICHUNG: 11. 12. 1991 TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 31. 01.
1992
DARMSTADT 1992 D17
IMAGE 2
INHALT
1
EINLEITUNG....-......................................................................................................
1
2 MATERIAL UND
METHODEN.......................................................................................
6
2.1 PFLANZENMATERIAL UND -ANZUCHT 6
2.2 BEZUGSGROESSEN 9
2.2.1 BESTIMMUNG DES CHLOROPHYLLGEHALTES 9
2.2.2 BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES 9
2.3 MESSUNG VON CAM-PARAMETERN 10
2.3.1 CO 2 -GASWECHSEL 10
2.3.2 MALATBESTIMMUNG 11
2.4 BEGASUNGSEXPERIMENTE MIT 14 CO 2 11
2.4.1 PROBENAUFARBEITUNG 11
2.4.2 BESTIMMUNG DER INHALTSSTOFFE DER WASSERLOESLICHEN FRAKTION 13 2.4.3
BERECHNUNG DES 14 C-EINBAUS 14
2.5 EXTRAKTION DER PEP-CARBOXYLASE..... 15
2.6 BESTIMMUNG DER PEP-CARBOXYLASE-AKTIVITAET 16
2.7 GELELEKTROPHORESE 17
2.7.1 , SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 17
2.7.2 FAERBEN DER PROTEINE AUF POLYACRYLAMIDGELEN 19
2.7.2.1 FAERBUNG MIT COOMASSIE BRILLIANT BLUE 19
2.7.2.2 SILBERFAERBUNG 19
2.7.3 TROCKNEN DER GELE 20
2.7.4 AUTORADIOGRAPHIE AN GETROCKNETEN GELEN 20
2.8 DARSTELLUNG DER PEP-CARBOXYLASE ALS ANTIGEN 20
2.9 IMMUNOLOGISCHE UND IMMUNCHEMISCHE METHODEN 21
2.9.1 IMMUNISIERUNG VON KANINCHEN 21
2.9.2 ISOLIERUNG VON IGG AUS ANTISERUM 22
2.9.3 ELISA ~ 23
2.9.4 IMMUNBLOT (WESTERN BLOT) 24
2.9.4.1 ELEKTROTRANSFER 24
2.9.4.2 AMIDOSCHWARZFAERBUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN PROTEINEN 25 2.9.4.3
IMMUNFAERBUNG MEMBRANGEBUNDENER PROTEINE 25
2.9.5 IMMUNPRAEZIPITATION 26
2.10 PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VITRO 27
2.10.1 VARIATION DES PH-WERTES 28
2.10.2 VARIATION DER MALATKONZENTRATION 29
2.11 PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VIVO 29
2.12 INKUBATION VON ROHEXTRAKTEN IN VITRO MIT ALKALISCHEN PHOSPHATASEN
31
2.13 BEGASUNG VON BLAETTERN VON KALANCHOE UNIFLORA MIT CO 2 -FREIER LUFT
34
IMAGE 3
2.14 DENSITOMETRISCHE AUSWERTUNG 35
2.15 STATISTISCHE ANGABEN 35
3 ERGEBNISSE 36
3.1 ANTIKOERPER AUS KANINCHEN GEGEN PEP-CARBOXYLASE AUS KALANCHOE
DAIGREMONTIANA 36
3.1.1 ISOLIERUNG VON PEP-CARBOXYLASE AUS VORGEREINIGTEM EXTRAKT DURCH
FPLC-MONO Q 36
3.1.2 ERZEUGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 40
3.1.3 ANREICHERUNG VON IGG AUS ANTISERUM 42
3.2 CHARAKTERISIERUNG DER TAG- UND NACHTFORM DER PEP- CARBOXYLASE AUS
KALANCHOE UNIFLOM 44
3.2.1 EINFLUSS VON TROCKENSTRESS AUF DIE MICHAEUS-KONSTANTE 44 3.2.2
K.-WERTE (MALAT) NACH 4 TAGEN TROCKENSTRESS 46
3.3 ^P-EINBAU IN DIE GESAMTFRAKTION DER LOESLICHEN BLATTPROTEINE UND IN
DIE PEP-CARBOXYLASE VON KALANCHOE UNIFLOM 47
3.4 KALANCHOE UNIFLOM: VERGLEICH VERSCHIEDENER CAM-PARAMETER MIT DER
REVERSIBLEN PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VIVO UND IN VITRO
UEBER 24 H IM LICHT/DUNKEL-RHYTHMUS 49
3.4.1 CO 2 -GASAUSTAUSCH 49
3.4.2 14 C-MARKIERUNGSMUSTER NACH BEGASUNG MIT 14 CO 2 ZU VERSCHIEDENEN
ZEITPUNKTEN IM TAG/NACHT-ZYKLUS 51
3.4.3 PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VIVO 54
3.4.4 PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VITRO 56
3.4.5 HEMMBARKEIT DER PEP-CARBOXYLASE DURCH MALAT 57
3.4.6 MALATGEHALT DES GEWEBES 58
3.4.7 ZUORDNUNG DER EIGENSCHAFTEN DER PEP-CARBOXYLASE ZUM DIUMALEN
VERHALTEN DER CAM-PARAMETER 58
3.5 PHOSPHORYLIERUNG DER PEP-CARBOXYLASE IN VITRO IM
LICHT/DUNKEL-WECHSEL ...61
3.5.1 KALANCHOE DAIGREMONTIANA 61
3.5.2 KALANCHOE UNIFLOM 63
3.6 PARTIELLE CHARAKTERISIERUNG DER PHOSPHORYLIERUNGSREAKTION IN VITRO
67
3.6.1 EINFLUSS VON L(-)MALAT 67
3.6.2 ABHAENGIGKEIT VOM PH-WERT 69
3.7 EINFLUSS VON ALKALISCHER PHOSPHATASE AUF DIE MALAT-SENSITIVITAET DER
PEP-CARBOXYLASE 70
3.7.1 INKUBATION ENTSALZTER ROHEXTRAKTE MIT LOESLICHER ALKALISCHER
PHOSPHATASE 70
3.7.2 INKUBATION ENTSALZTER ROHEXTRAKTE MIT UNLOESLICHER ALKALISCHER
PHOSPHATASE 75
3.7.3 INKUBATION MIT UNLOESLICHER ALKALISCHER PHOSPHATASE ZU
VERSCHIEDENEN ZEITPUNKTEN DES TAG/NACHT-ZYKLUS 78
3.7.4 EINFLUSS VON ALKALISCHER PHOSPHATASE AUF DIE MALAT-SENSITIVITAET
IMAGE 4
DER PEP-CARBOXYLASE NACH BEGASUNG MIT CO 2 -FREIER LUFT IN DER
DUNKELPERIODE 80
3.8 INKUBATION ANDERER CAM-PFLANZEN UND GEWEBEKULTUREN MIT
^P-ORTHOPHOSPHAT UNTER» VIVO BEDINGUNGEN IM TAG/NACHT- ZYKLUS 83
3.8.1 MALATGEHALT DER VERWENDETEN PFLANZEN UND GEWEBEKULTUREN 84 3.8.2
SCHLUMBERGERA SP. UND IHRE MIXOTROPHE KALLUSKULTUR. 85
3.8.3 MIXOTROPHE KALLUSKULTUREN VON MESEMBIYANTHEMUM AYSTALUNUM MIT UND
OHNE NACL IM NAEHRMEDIUM 87
3.8.4 C 3 - UND CAM-FORM VON MESEMBIYANTHEMUM AYSTALUNUM 87
4 DISKUSSION 89
5
ZUSAMMENFASSUNS............................................................................................
104
6 LITERATUR.... ... .... . 106
7 ANHANG ... ...... ...... *.... 117
|
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