Entwicklung eines Xylose verwertenden Zymomonas mobilis Stammes durch Expression der aus Klebsiella pneumoniae KAY2026 klonierten und charakterisierten Gene für Xyloseisomerase und Xylulokinase und des Transketolase-Gens aus Escherichia coli K12:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralbibl.
1991
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2544 |
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| adam_text | ENTWICKLUNG EINES XYLOSE VERWERTENDEN ZYMOMONAS MOBILIS STAMMES DURCH
EXPRESSION DER AUS KLEBSIEILA PNEUMONIAE KAY2026 KLONIERTEN UND
CHARAKTERISIERTEN GENE FUER XYLOSEISOMERASE UND XYLULOKINASE UND DES
TRANSKETOLASE-GENS AUS ESCHERICHIA COLI K12 SIGRUN FELDMANN FRR
INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGEN I. EINLEITUNG 1 II. MATERIAL UND METHODEN
8 1. CHEMIKALIEN UND ENZYME 8 2 . BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE 9 3.
NAEHRMEDIEN UND KULTURBEDINGUNGEN 13 4 . BESTIMMUNG DES
BAKTERIENWACHSTUMS 16 5. GENETISCHE METHODEN 16 5.1. TRANSFORMATION VON
E. COLI 16 5.2. FILTERKREUZUNG VON E.COLI UND Z.MOBILIS 17 5.3.
PLASMIDSTABILITAETSTEST 17 5.4. TRANSPOSONMUTAGENESE 18 5.5.
UV-MUTAGENESE 18 6. PRAEPARATION UND REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN 19 6.1.
ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA 19 6.2. PLASMIDISOLIERUNG IM GROSSEN MASSSTAB
19 6.3. PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG AUS E.COLI UND Z.MOBILIS 20 6.4.
ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS E.COLI UND K. PNEUMONIAE 21 6.5.
PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG VON NUKLEINSAEURE- KONZENTRATIONEN 22 7.
TECHNIKEN ZUR REKOMBINATION UND ANALYSE VON DNA 22 7.1. SPALTUNG VON DNA
MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN . . 22 7.2. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 23
7.3. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN. . 23 7.4.
VERKUERZUNG ENZYMATISCH GESPALTENER DNA MIT EXONUKLEASE III 24 7.5.
BEHANDLUNG UEBERHAENGENDER DNA-ENDEN MIT KLENOW- POLYMERASE 24 7.6.
LIGATION RESTRINGIERTER DNA-MOLEKUELE 25 7.7. DNA-SEQUENZIERUNG NACH
SANGER 25 7.8. DNA-MARKIERUNG MIT DIGOXIGENIN-DUTP 27 7.9. DNA-DNA
HYBRIDISIERUNG 27 7.9.1. DNA-DNA HYBRIDISIERUNG NACH SOUTHERN 27 7.9.2.
KOLONIEHYBRIDISIERUNG 28 7.10.IN VITRO VERPACKUNG VON DNA IN INFEKTIOESE
PARTIKEL DES PHAGEN X 28 8. TECHNIKEN ZUR ANALYSE VON RNA 29 8.1.
RNA-MARKIERUNG MIT DIGOXIGENIN-UTP 29 8.2. RNA-MARKIERUNG MITC^ 5 S-CTP
30 8.3. RNA-RNA HYBRIDISIERUNG 30 8.4. BESTIMMUNG VON
TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTEN 31 9. BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN UND
ATP IM ROHEXTRAKT 31 9.1. HERSTELLUNG VON ZELLFREIEN ROHEXTRAKTEN 31
9.2. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN 32 9.3.
PROTEINBESTIMMUNG 32 9.4. TESTANSAETZE 32 9.5. ATP-BESTIMMUNG 37 10.
BESTIMMUNG INTERNER ZUCKER- UND ZUCKERPHOSPHAT- KONZENTRATIONEN MIT
HILFE DER SILIKONOELZENTRIFUGATION 37 10.1. SILIKONOELZENTRIFUGATION 37
10.2. NACHWEIS VON ALDOSEN UND KETOSEN MITTELS BORAT-
KOMPLEX-CHROMATOGRAPHIE MIT ANIONENAUSTAUSCHER . 38 10.3. NACHWEIS VON
ZUCKERALKOHOLEN 39 11. UMSATZ VON 14 C-[U]-XYLOSE 40 III. ERGEBNISSE 42
1. KLONIERUNG UND MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DES XYLOSE-
OPERONS AUS K. PNEUMONIAE KAY 2026 42 1.1. HERSTELLUNG EINER
COSMID-GENBANK AUS K.PNEUMONIAE KAY 2026 UND ISOLIERUNG DER XYLOSE-GENE
42 1.2. RESTRIKTIONSKARTIERUNG DER XYLOSE-GENE AUF DEM PLASMID PZY190
UND TRANSPOSONMUTAGENESE DER PLASMIDE PZY190 UND PZY240 45 1.3.
EXPRESSION DER VERSCHIEDENEN KONSTRUKTE IN E. COLI STAEMMEN 50 1.4.
SEQUENZANALYSE DES XYLOSE-OPERONS AUS K.PNEU- MONIAE KAY 2026 52 1.5.
CHARAKTERISIERUNG DES XYLOSE-OPERONS AUF TRANS- KRIPTIONSEBENE 60 1.6.
UNTERSUCHUNG DES IN TRANS VERMITTELTEN XYLOSE- NEGATIVEN PHAENOTYPS 62
1.6.1. ENTFERNUNG DES PROMOTORS DER XYLOSE-GENE UND REKONSTITUTION DES
OPERONS 65 2. UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION DER XYLOSEISOMERASE UND
XYLULOKINASE IN Z.MOBILIS 7 3 2.1. KONSTRUKTION VON VEKTOREN FUER DIE
EXPRESSION DER XYLOSE-GENE IN Z.MOBILIS 73 2.2. EXPRESSION DER
XYLOSE-GENE IN Z.MOBILIS UND CHARAKTERISIERUNG DER XYL + REKOMBINANTEN
STAEMME. 81 2.3. ISOLIERUNG XYLOSE-RESISTENTER, REKOMBINANTER Z.MOBILIS
STAEMME . . . 89 2.4. UNTERSUCHUNG DER ENZYME DES NICHT OXIDATIVEN
PENTOSE-PHOSPHAT-WEGES IN Z.MOBILIS 92 3. EINFUEHRUNG DES
TRANSKETOLASE-GENS AUS E.COLI IN DIE XYLAB - REKOMBINANTEN Z.MOBILIS
STAEMME 96 3.1. KLONIERUNG DER TRANSKETOLASE-GENS IN DAS PLASMID
PZY225-XR4 96 3.2. CHARAKTERISIERUNG TKT + XYLAB + - REKOMBINANTER
Z.MOBILIS STAEMME 98 IV. DISKUSSION 102 V. ZUSAMMENFASSUNG 115 VI.
LITERATURHINWEISE 117
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