Methoden der Biochemie: 24 Tabellen
Gespeichert in:
| Format: | Buch |
|---|---|
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Stuttgart [u.a.]
Thieme
1991
|
| Ausgabe: | 3., neubearb. und erw. Aufl. |
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Literaturangaben. - 2. Aufl. u.d.T.: Williams, Bryan L.: Methoden der Biochemie |
| Beschreibung: | XXI, 479 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3135493032 |
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und SI-Einheiten .........XVIII
Kapitel 1
Allgemeine Grundlagen biochemischer Untersuchungen . . 1
1.1 Einführung ............... 1
1.2 pH-Wert und Puffer ............ 5
Auswirkungen des pH auf biologische Vorgänge ... 5
pH-abhängige Dissoziation der Aminosäuren und Proteine 6
Pufferlösungen in der Biochemie ........ 11
1.3 Physiologische Lösungen........... 14
Nährstoffmedien der Mikrobiologie ....... 14
Nährstoffmedien für Pflanzenzellen ....... 14
Nährstoffmedien für tierische Zellen....... 15
Medien zur Isolierung von Organellen und zum Gewebs-
homogenisieren.............. 15
1.4 Untersuchungen an Gesamtorganismen ...... 16
Gesamttier ............... 16
Pflanzen ................ 18
1.5 Schnittechniken für Organe und Gewebe ..... 19
Perfusion isolierter Organe .......... 19
Schnittechniken.............. 20
1.6 Gewebe- und Zellkultur ........... 21
Mikroorganismen ............. 21
Züchtung von tierischen Geweben und Zellen .... 23
Züchtung von Pflanzengeweben und -zellen..... 27
Fraktionierung ganzer Zellen ......... 30
Zellzählung ............... 32
Kälteaufbewahrung............. 34
Stammsammlungen............. 35
1.7 Mutanten in der Biochemie.......... 35
Klassifizierung von Mutanten ......... 36
Selektion von Mutanten ........... 37
1.8 Fraktionierung des Zellinhalts ......... 38
Aufschluß von Geweben und Zellen....... 39
1.9 Mikroskopie............... 41
Energiedispersive Röntgenmikroanalyse...... 43
Inhaltsverzeichnis
Probenvorbereitung der Mikroskopie....... 45
Zytochemie ............... 47
1.10 Grundtechniken zur Stoffwechseluntersuchung ... 49
Literatur ................ 54
Kapitel 2
Zentrifugation................ 55
2.1 Einführung ............... 55
2.2 Grundlagen ............... 56
2.3 Zentrifugen und ihre Anwendung........ 61
Tischzentrifugen.............. 62
Großvolumige Kühlzentrifugen......... 62
Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifugen ...... 62
Durchflußzentrifugen............ 63
Präparative Ultrazentrifugen.......... 63
Analytische Ultrazentrifugen ......... 64
2.4 Bau und Pflege präparativer Rotoren....... 67
Materialmerkmale der Rotoren......... 67
Festwinkel- und Schwingbecher-Rotoren...... 68
Vertikalrotoren.............. 68
Durchflußrotoren ............. 69
Elutriationsrotoren............. 69
Zonalzentrifugationsrotoren.......... 70
Wartung der Rotoren............ 74
2.5 Material der Behältnisse........... 76
2.6 Dichtegradientenzentrifugation......... 77
Herstellung und Wahl der Dichtegradienten .... 77
Probenauftrag .............. 78
Rückgewinnung und Auswertung der Gradientenlösungen 79
Art und Wahl der Gradienten ......... 79
2.7 Präparative Zentrifugation .......... 82
Differenzialzentrifugation .......... 82
Dichtegradientenzentrifugation......... 85
Elutriationszentrifugation........... 87
2.8 Auswahl. Ausbeute und Anwendung bei präparativen Ro-
toren ................. 88
2.9 Untersuchung subzellulärer Fraktionen ...... 91
Kriterien der Homogenität .......... 91
Auswertung ............... 91
2.10 Anwendungen der analytischen Ultrazentrifuge ... 92
Bestimmung der relativen Molekülmassen MJ1 .... 92
Reinheitskontrolle bei Makromolekülen...... 95
Konformationsänderungen von Makromolekülen ... 95
Inhaltsverzeichnis XI
2.11 Sicherheitsbestimmungen bei dem Betrieb von
Zentrifugen ............... 96
Literatur ................ 97
Kapitel 3
Enzymatische Methoden ............ 98
3.1 Einführung ............... 98
3.2 Aktivitätseinheiten und Reinigung von Enzymen . . . 101
Aktivitätseinheiten............. 101
Proteinbestimmungen............ 102
Reinigungsmethoden ............ 103
3.3 Kinetik bei konstantem Umsatz (steady-state) .... 107
Anfangsgeschwindigkeiten .......... 107
Änderungen der Anfangsgeschwindigkeit durch die
Substratkonzentration............ 109
Änderungen der Anfangsgeschwindigkeit durch die
Enzym-Konzentration............ 117
Änderungen der Anfangsgeschwindigkeit durch die
Temperatur ............... 117
Änderungen der Anfangsgeschwindigkeit durch den
pH-Wert ................ 118
Einfluß von Inhibitoren auf die Anfangsgeschwindigkeit 118
Regulation der Enzymaktivität durch die Zelle . . . 122
3.4 Bestimmung der Enzymaktivität ........ 123
Spektrophotometrische Verfahren im sichtbaren und
ultravioletten Licht............. 124
Spektrofluorimetrische Verfahren ........ 126
Lumineszenzverfahren............ 126
Einsatz von Radioisotopen .......... 127
Manometrische Verfahren .......... 128
Verfahren mit ionenselektiven und Sauerstoff-Elektroden 129
Immunochemische Verfahren ......... 129
Mikrokalometrische Verfahren......... 129
Automatisierte Enzymaktivitätsbestimmungen .... 130
3.5 Bestimmungen von Substraten......... 130
3.6 Kinetik vor dem Steady-state ......... 131
Schnelle Durchmischung........... 131
Relaxationsverfahren ............ 133
Messungen von Zwischenprodukten ....... 134
3.7 Bindungsmessungen an Proteinen........ 135
Grundlagen ............... 135
Gleichgewichtsdialyse............ 137
Ultrafiltration .............. 138
3.8 Immobilisierte Enzyme ........... 139
Literatur ................ 140
XII Inhaltsverzeichnis
Kapitel 4
Immunochemische Verfahren (D. H. Bunin)...... 141
4.1 Grundlagen ............... 141
Definitionen............... 144
Präzipitation............... 147
Präparative Anwendungen der Antigen-Antikörper-
Reaktion................ 147
4.2 Herstellung von Antikörpern ......... 148
Erzeugung von Antiseren (polyklonale Antikörper) . . 148
Herstellung von monoklonalen Antikörpern . . . . 151
4.3 Präzipitation in Lösung ........... 155
Grundlagen ............... 155
Qualitative Bestimmung der Antigene ...... 156
Quantitative Bestimmung der Antigene...... 156
Hapten-Inhibition-Tests ........... 157
4.4 Präzipitation in Gelen: Immunodiffusion ID .... 160
Grundlagen ............... 160
Unidirektionale (einfache) Immunodiffusion .... 160
Doppeldiffusion.............. 162
Immunelektrophorese (IE) .......... 165
Darstellung und Aufzeichnung der Präzipitationsbanden 170
4.5 Radioimmunoassay RIA........... 170
Grundlagen ............... 170
Praktische Durchführung........... 172
Immunradiometrische Bestimmungen (IRMA) .... 174
4.6 Enzymgebundener Immunoassay (ELISA)..... 174
Grundlagen ............... 174
Praktische Durchführung........... 179
Anwendungen .............. 180
4.7 Fluoreszenzsimmunoassay FIA......... 181
Immunfluoreszenz IF............ 181
Fluoreszenzimmunoassay mit homogenem markiertem
Substrat (SLFIA) ............. 182
Verzögerter Fluoreszenzimmunoassay durch Lanthanide
(DELFIA) ............... 183
Durchflußzytofluorimetrie und Zelltrennungen nach
Fluoreszenzmarkierung (FACS)......... 185
4.8 Partikelgebundene Immunoassays (PACIA)..... 185
4.9 Komplementbindung ............ 186
Grundlagen ............... 186
Praktische Durchführung........... 188
Literatur ................ 189
Inhaltsverzeichnis XIII
Kapitel 5
Molekularbiologische Verfahren (S. Boffey) ...... 190
5.1 Einführung ............... 190
5.2 Struktur der Nucleinsäuren .......... 191
Bausteine und Primärstruktur der Nucleinsäuren . . . 191
Sekundärstruktur der Nucleinsäuren....... 193
5.3 Funktionen der Nucleinsäuren......... 198
Ribonucleinsäure-Familien .......... 198
Replikation der DNS ............ 198
Transkription............... 200
Translation ............... 201
5.4 Reinigung der Nucleinsäuren ......... 203
DNS ................. 203
RNS ................. 204
5.5 DNS-Analyse .............. 205
Elektrophorese.............. 205
Sequenzierung .............. 208
Protein-Sequenzierung............ 211
Kinetik der Renaturierung .......... 215
5.6 Grundzüge der genetischen Manipulation ..... 216
5.7 Enzyme für die genetische Manipulation...... 218
Restriktionsendonucleasen .......... 218
Ligasen ................ 219
5.8 Klonierungsvektoren ............ 223
Plasmide ................ 223
Virale DNS ............... 229
Kosmide ................ 230
Vektoren für Eukaryonten .......... 232
5.9 Reinigung spezifischer Nucleinsäure-Fraktionen . . . 233
Komplementäre DNS............ 233
Genbanken ............... 237
Hybridisierung in Kolonien.......... 239
Nick-Translation.............. 239
Oligonucleotid-Sonden ........... 239
5.10 Expression einzelner Gene .......... 241
5.11 Sicherheitsverfahren bei Klonierungen ...... 242
5.12 Anwendungen der Molekularbiologie....... 243
Literatur ................ 245
Kapitel 6
Chromatographische Arbeitsweisen (K. Wilson)..... 246
6.1 Grundlagen der Chromatographie........ 246
Allgemeine Arbeitsvorschriften......... 246
Säulenchromatographie ........... 250
XIV Inhaltsverzeichnis
Dünnschichtchromatographie (DC oder TLC von thin
layer chromatography)............ 259
Papierchromatographie ........... 262
6.2 Adsorptionschromatographie ......... 263
Grundlagen ............... 263
Träger und Anwendungen .......... 264
6.3 Verteilungschromatographie.......... 265
Flüssig-flüssig-Chromatographie ........ 265
Gegenstromverteilung............ 266
6.4 Gaschromatographie (GC oder GLC von gas-liquid-
chromatography) ............. 267
Träger und Geräte............. 267
Anwendungen .............. 272
6.5 Ionenaustauschchromatographie ........ 273
Grundlagen ............... 273
Träger................. 274
Durchführung und Anwendungen........ 277
6.6 Ausschlußchromatographie (Molekularsiebchromato-
graphie) ................ 280
Grundlagen ............... 280
Träger................. 283
Anwendungen .............. 285
6.7 Affinitätschromatographie .......... 286
Grundlagen ............... 286
Träger................. 288
Anwendungen .............. 291
6.8 High-performance (pressure) liquid chromatography
HPLC................. 293
Grundlagen ............... 293
Geräte und Träger............. 294
Anwendungen .............. 300
6.9 Wahl eines chromatographischen Trennsystems .... 301
Literatur ................ 303
Kapitel 7
Elektrophorese (M. G. Davis)........... 304
7.1 Einführung ............... 304
7.2 Einflüsse auf die Wanderungsgeschwindigkeit .... 306
Elektrisches Feld ............. 306
Proben................. 308
Pufferlösungen .............. 308
Trägermaterialien ............. 310
7.3 Niederspannungselektrophoresen in dünnen Schichten . 311
Träger................. 311
Geräte und Verfahren............ 312
Inhaltsverzeichnis XV
7.4 Hochspannungselektrophorese (HVE) ...... 314
7.5 Gelelektrophoresen............. 316
Träger................. 316
Geräte und Verfahren............ 318
7.6 Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektro-
phorese ................ 321
Grundlagen ............... 321
Geräte und Verfahren............ 321
7.7 Isoelektrische Fokussierung.......... 322
Grundlagen ............... 322
Geräte und Verfahren............ 324
7.8 Isotachophorese.............. 326
Grundlagen ............... 326
Geräte und Verfahren............ 327
7.9 Präparative Elektrophorese.......... 328
7.10 Nachweis, Rückgewinnung und Auswertung .... 330
Literatur ................ 334
Kapitel 8
Spektroskopische Verfahren (D. H. Burrin) ...... 335
8.1 Grundlagen ............... 335
Strahlung, Energie und Atomstruktur ...... 335
Aufzählung verschiedener Spektren und ihre biochemische
Anwendung ............... 337
Grundgesetze der Lichtabsorption........ 339
8.2 Spektren im sichtbaren und ultravioletten Bereich (UV) 340
Grundlagen ............... 340
Geräte................. 341
Anwendungen .............. 345
8.3 Infrarot-(IR)-Spektrophotometrie........ 352
8.4 Zirkulardichroismus CD........... 353
Grundlagen ............... 353
Geräte................. 355
Anwendungen .............. 355
8.5 Spektralfluorimetrie ............ 357
Grundlagen ............... 357
Geräte................. 359
Anwendungen .............. 361
8.6 Luminometrie .............. 367
Grundlagen ............... 367
Geräte................. 367
Anwendungen .............. 368
8.7 Atomadsorptions- und Flammenspektrophotometrie . . 369
Grundlagen ............... 369
XVI Inhaltsverzeichnis
Geräte der Atomemissionsspektrophotometrie .... 372
Geräte der Atomabsorptionsspektrophotometrie . . . 372
Atomabsorptionsspektrophotometrie ohne Flamme . . 373
Anwendungen der Flammenspektrophotometrie . . . 373
Atomfluoreszenzspektrophotometrie....... 375
8.8 Elektronenspinresonanzspektrometrie ESR..... 375
Grundlagen ............... 375
Geräte................. 377
Anwendungen .............. 378
8.9 Magnetische Kernresonanzspektrometrie NMR . . . 379
Grundlagen ............... 379
Geräte................. 380
Anwendungen .............. 381
8.10 Massenspektrometrie ............ 382
Grundlagen ............... 382
Geräte................. 384
Anwendungen .............. 386
8.11 Tabellarische Zusammenfassung der spektroskopischen
Verfahren................ 388
Literatur ................ 390
Kapitel 9
Radioaktive Isotope (K. H. Goulding)........ 391
9.1 Eigenschaften der Radioaktivität ........ 391
Struktur des Atoms ............ 391
Lebensdauer der Atome und Strahlung...... 392
Zerfallsraten............... 392
Energie der radioaktiven Strahlung ....... 393
Geschwindigkeit des radioaktiven Zerfalls ..... 394
Einheiten der Radioaktivität ......... 396
Einfluß radioaktiver Strahlung......... 396
9.2 Nachweis und Messung der Radioaktivität..... 398
Absolute oder relative Zählweise ........ 398
Methoden, die auf der Ionisierung von Gasen beruhen . 398
Methoden, die auf einer Anregung beruhen .... 403
Methoden unter zu Hilfenahme photographischer
Emulsionen ............... 417
9.3 Praxis der Zählung von Radioaktivitäten und ihre
Auswertung ............... 421
Zähler................. 421
Proben und Isotope ............ 421
Erwerb, Lagerung und Reinheit radioaktiver
Verbindungen .............. 423
Inhaltsverzeichnis XVII
9.4 Immanente Vorteile und Begrenzungen der Versuche
mit Markierungsverbindungen ......... 423
9.5 Anwendung radioaktiver Substanzen in der Biologie . . 424
Stoffwechseluntersuchungen.......... 424
Analytische Anwendungen .......... 426
Weitere Anwendungen ........... 427
9.6 Sicherheitsvorschriften............ 428
Literatur ................ 430
Kapitel 10
Elektrochemische Verfahren (M. R. Jenkins)...... 431
10.1 Einführung ............... 431
Der Anwendungsbereich elektrochemischer Verfahren . 431
Elektronentransport ............ 433
Grundzüge der elektrochemischen Verfahren .... 439
10.2 pH-Messungen mit Glaselektroden ....... 443
Grundlagen der Anwendung.......... 443
DerpH-Stat............... 445
Messung des ApH- und des Au-Wertes ...... 446
10.3 Ionenselektive Elektroden ISE und Gasmessungen . . 448
Einführung ............... 448
Anwendungen ionenselektiver Elektroden ..... 451
10.4 Oxidation-Reduktions-(Redox-)Potentiale ..... 452
Grundlagen ............... 452
Potentiometrische Titrationen bei Redox-Reaktionen . 453
Redox-Indikatoren und ihre Anwendungen..... 455
10.5 Sauerstoff-Elektrode ............ 456
Grundlagen ............... 456
Bauweisen der Sauerstoff-Elektroden....... 457
Anwendung einer Clark-Elektrode (Rank-Elektrode) . 458
Anwendungen der Sauerstoff-Elektroden ..... 461
10.6 Biosensoren ............... 464
Einführung und Grundlagen.......... 464
Enzymelektroden ............. 466
Bakterienelektroden (Biosensoren auf Zellgrundlage) . 467
Enzymimmunosonden............ 470
10.7 Elektrochemische Detektoren ......... 470
Literatur ................ 474
Sachverzeichnis................ 475
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