Feinstruktur zweier gewebespezifischer regulatorischer Elemente des Hühnerlysozymgens:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1988
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
.
2
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
7
3.1.
ALLGEMEINES
.
7
3.1.1.
MATERIALIEN
.
7
3.1.2.
GERAETE
.
8
3.1.3.
ARBEITSVORBEREITUNGEN
.
8
3.1.3.1
STERILITAET
.
8
3.1.3.2.
SILIKONISIEREN
VON
GEFAESSEN
UND
GLASPLATTEN
.
SS
3.1.3.3.
ULTRASCHALLZERKLEINERUNG
HOCHMOLEKULARER
DNA
.
8
3.2.
HERSTELLUNG
UND
ANALYSE
REKOMBINANTER
DNA
.
9
3.2.1.
MEDIEN
UND
PUFFER
.
9
3.2.2.
BAKTERIENSTAEMME
.
9
3.2.3.
GELELEKTROPHORESEN
VON
NUKLEINSAEUREN
.
10
3.2.3.I.
VORBEMERKUNGEN
.
10
3.2.3.2.
PUFFER
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
10
3.2.3.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESEN
.
10
3.2.3.3.I.
NICHT-DENATURIERENDE
GELE
.
10
3.2.3.3.2.
DENATURIERENDE
GELE
.
11
3.2.3.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESEN
.
11
3.2.4.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA
.
11
3.2.4.I.
ELUTION
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
POLYACRYLAMID-GELEN
.
11
3.2.4.2.
CHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
DNA
MIT
ELUTIP-SAEULEN
.
12
3.2.4.3.
FAELLUNG
VON
DNA
MIT
ETHANOL
.
12
3.2.5.
ARBEITEN
MIT
CHEMISCH
SYNTHETISIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
12
3.2.5.I.
REINIGUNG
CHEMISCH
SYNTHETISIERTER
OLIGONUKLEOTIDE
.
12
3.2.5.2.
5'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
.
13
3.2.5.3.
ASOZIATION
EINZELSTRAENGIGER
OLIGONUKLEOTIDE
.
.13
3.2.6.
IN
VITRO-MANIPULATIONEN
VON
DNA
.
13
3.2.6.I.
RESTRIKTIONSVERDAUUNGEN
VON
DNA
.
13
3.2.6.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
13
3.2.6.3.
AUFFUELLEN
UEBERHAENGENDER
5'-ENDEN
MIT
DNA-POLYMERASE
.
14
3.2.6.4.
LIGATION
VON
DNA
.
14
3.2.7.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
MIT
PLASMID-DNA
.
.14
3.2.7.I.
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
E.COLI
.
14
3.2.7.2.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
PLASMID-DNA
.
15
3.2.8.
REINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
.
15
3.2.8.1
.
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
15
3.2.8.2.
PLASMIDPRAEPARATION
IM
GROSSEN
MASSSTAB
.
15
3.2.9.
SEQUENZANALYSE
VON
DNA
.
16
3.2.9.I.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
.
16
3.2.9.2.
PURINSPEZIFISCHE
SPALTUNG
VON
DNA
.
17
3.2.10.
ERZEUGUNG
NEUER
REKOMBINANTER
PLASMIDE
.
.18
3.3.
DNA-TRANSFER
IN
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
UND
EXPRESSIONSANALYSE
.
18
3.3.1.
PRINZIP
DES
TRANSIENTEN
GENTRANSFERS
.
18
3.3.2.
ZELLKULTUR
.
.18
3.3.2.I.
MEDIEN
UND
PUFFER
.
.18
33.2.2.
VERWENDETE
PERMANENTE
ZELLINIEN
.
19
33.2.3.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLINIEN
.
19
33.2.4.
AUFTAUEN
VON
ZELLINIEN
.
20
33.2.5.
EINFRIEREN
UND
LAGERUNG
VON
ZELLEN
.
20
33.3.
DNA-TRANSFER
.
20
33.3.1.
VORBEMERKUNGEN
.
20
33.3.2.
DEAE-DEXTRAN-TRANSFER
.
20
33.3.3.
CALCIUMPHOSPHAT-COPRAEZIPITATION
.
21
33.3.4.
BENUTZTE
TRANSFERMETHODEN
.
22
33.4.
ENZYMATISCHE
CAT-AKTIVITAETSBESTIMMUNG
NACH
DNA-TRANSFER
.
22
33.4.1.
ZELLEMTE
UND
AUFSCHLUSS
.
22
33.4.2.
PROTEINBESTIMMUNG
.
22
33.4.3.
CAT-AKTIVITAETSTEST
.
22
33.5.
RNA-ANALYSE
NACH
DNA-TRANSFER
.
23
33.5.1.
EXTRAKTION
VON
GESAMT-RNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLINIEN
.
23
33.5.2.
ENZYMATISCHE
SYNTHESE
RADIOAKTIV
MARKIERTER
RNA
.
24
33.5.3.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
KORREKT
INITIIERTER
MRNA
.
25
3.4.
IN
VITRO
ANALYSE
VON
DNA-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
.
25
3.4.1.
HERSTELLUNG
RADIOAKTIVER
DNA-PROBEN
.
25
3.4.1.1.
RADIOAKTIVE
3'-ENDMARKIERUNG
VON
DNA
.
25
3.4.12.
EINSEITIGE
RADIOAKTIVE
ENDMARKIERUNG
VON
DNA
.
26
3.4.2.
HERSTELLUNG
VON
KEMEXTRAKTEN
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
26
3.4.3.
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
.
27
4.
ERGEBNISSE
.
29
4.1.
REKOMBINANTE
PLASMIDE
.
29
4.1.1.
VORBEMERKUNGEN
.
29
4.1.2.
VORAUSSETZUNGEN
ZUR
KLONIERUNG
.
29
4.12.1.
SEQUENZEN
DER
BEIDEN
BEARBEITETEN
"ENHANCER"
DES
LYSOZYMGENS
.
.
29
4.1.22.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
31
4.1.23.
VERWENDETE
AUSGANGSPLASMIDE
.
32
4.1.3.
ERZEUGUNG
NEUER
REKOMBINANTER
PLASMIDE
.
35
4.13.1.
VORBEMERKUNGEN
.
35
4.13.2.
SUBKLONE
DES
SV
40
UND
DER
LYSOZYMGEN-"ENHANCER"
E-2,7
KB
UND
E-02
KB
IN
PUC
UND
PLC-PLASMIDEN
.
35
4.1.33.
PLASMIDE
ZUR
EXPRESSION
VON
CAT-ENZYM
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
.
38
4.13.3.1.
FUSIONEN
ZWEIER
SUBREGIONEN
DES
-02
KB
LYSOZYMGEN-"ENHANCERS"
MIT
TKCAT
.
38
4.1.3.3.2.
KLONIERUNG
VERSCHIEDENER
VIRALER
UND
ZELLULAERER
"ENHANCER"
VOR
TKCAT
.
41
4.13.4.
PLASMIDE
ZUR
IN
VITRO-SYNTHESE
VON
RNA
.
41
4.13.5.
SEQUENZIERUNG
DER
NEU
ERZEUGTEN
LYSOZYM-TKCAT-FUSIONSPLASMIDE
.
.
43
4.2.
AKTIVITAET
DES
LYSOZYMGEN-'ENHANCERS"
E-02
KB
IN
MENSCHLICHEN
ZELLINIEN
.
47
4.2.1.
IN
TROO-TESTS
.
47
42.1.1.
AKTIVITAETSNACHWEIS
IN
MAMMAKARZINOMZELLEN
.
.47
4.2.12.
SPEZIFITAET
DES
LYSOZYMGEN-'ENHANCERS"
E-02
KB
IN
MCF-7
ZELLEN
.
.
.
.
48
4.2.13.
IN
TROO-WECHSELWIRKUNGEN
VON
E-02
KB
MIT
DIFFUNDIERBAREN
KOMPONENTEN
MENSCHLICHER
BRUSTDRUESENZELLINIEN
.
50
IV
4.3.
ERKENNUNG
BEIDER
LYSOZYMGEN-"ENHANCER
"
IN
HUEHNERZELLINIEN
.
52
4.3.1.
VORBEMERKUNGEN
.
52
4.3.2.
AKTIVITAETS
UND
SPEZIFITAETSNACHWEIS
IN
HUEHNERZELLEN
.
52
4.3.3.
IN
TTFFRP-WECHSELWIRKUNGEN
DER
LYSOZYMGEN
'
'ENHANCER"
E-0,2
KB
UND
E-2,7
KB
MIT
KERNPROTEINEN
AUS
HUEHNERZELLEN
.53
4.3.3.1
.
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
MIT
E-0,2
KB
.
53
4.3.3.2.
DNASEL-SCHUTZEXPENMENTE
MIT
E-2,7
KB
.
55
4.3.4.
SPEZIFITAET
DER
BINDUNG
VON
KEMPROTEINEN
AUS
HUEHNERPROMAKRO
PHAGEN
AUF
DEN
LYSOZYMGEN
UND
DEM
SV
40-'
'
ENHANCER"
.
57
4.3.4.I.
SPEZIFITAET
DER
PROTEINBINDUNG
AUF
E-0,2
KB
.
57
4.3.4.2.
SPEZIFITAET
DER
PROTEINBINDUNG
AUF
E-2,7
KB
.
58
4.3
4.3.
IN
WFRO-BINDUNGSVERSUCHE
MIT
DEM
SV
40-"ENHANCER"
.
59
4.4.
FEINSTRUKTUR
DES
LYSOZYMGEN-"ENHANCERS"
E-0,2
KB
.
61
4.4.1.
KOOPERATIVITAET
DER
DOMAENEN
VON
E-0,2
KB
.
61
4.4.1.1.
CAT-EXPRESSION
DER
PLASMIDE
PTKCAT107
BIS
PTKCAT115
IN
HUEHNERZELLINIEN
.
61
4.4.1.2.
BENUTZUNG
DER
KORREKTEN
TRANSKRIPTIONSSTARTSTELLE
IN
DEN
PLAS
MIDEN
PTKCAT107
BIS
PTKCAT115
.
62
4.4.2.
STEREOSPEZIFISCHE
VORAUSSETZUNGEN
FUER
DIE
AKTIVITAET
VON
E-0,2
KB
.
65
5.
DISKUSSION
.
67
5.1.
ERKENNUNG
DES
LYSOZYMGEN-"ENHANCERS
'
'
E-0,2
KB
IN
MENSCHLICHEN
MAMMAKARZINOMZELLEN
.67
5.2.
WECHSELWIRKUNGEN
BEIDER
"ENHANCER"
MIT
KEMKOMPONENTEN
AUS
HUEHNERZELLEN
UND
FEINSTRUKTUR
VON
E-0,2
KB
.
.
.
.
.68
5.3.
AUSBLICK
.
72
6.
LITERATURVERZEICHNS
.
74
V |
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