Methoden der Zellforschung:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Stuttgart
Franckh
1966
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Methoden der
Zellforschung
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KOSMOS-GESELLSCHAFT DER NATURFREUNDE
FRANCKH SCHE YERLAGSHANDLUNG • STUTTGART
METHODEN DER
ZELLFORSCHUNG
VORWORT 5
1 TEIL: LICHTMIKROSKOPISCHE UNTER
SUCHUNGSMETHODEN 15
OPTISCHE VERFAHREN 15
DAS MIKROSKOP 15
Einleitung 15
Geometrisch-optische Grundlagen der Abbildung 1 5
Beleuchtungsstrahlengang 17
Wellenoptische Grundlagen der Abbildung 18
Das Objektiv 24
Einfluß der Deckglasdicke 24
Messung der Deekglasdicke 25
Immersionen 25
Die Objektivtypen 26
Kennzeichnung der Objektive 31
Das Okular 31
* Der Kondensor 33
MIKROPHOTOGRAPHIE 34
Apparative Ausrüstung 34
Kamera mit Mattscheiben-Einstellung 35
Kamera mit seitlichem Beobacht ungsokular 35
Kameramikroskope 36
Mikrophotographie mit handelsüblichen Kleinbildkameras 36
Der Einfluß von Abbildungsfehlern auf die Aufnahme • • 37
Abweichungen von der Sinusbedingung 37
Bildfeldwölbung 37
1 Chromatische Aberration 38
Die Verwendung von Filtern 38
Belichtung und Kontrast 41
Eigenschaften und Verarbeitung der Photoschichten 4 4
Farbmikrophotographie 46
PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE 47
Grundlagen 47
Amplitudenobjekte und Phasenobjekte 47
Phasenkontrast • 48
Das Phasenkontrastmikroskop 49
Die Bildeigenschaften heim Phasenkontrast 50
Anwendungen zur Bestimmung von Brechzahl, Konzen
tration und Wassergehalt an lebenden Zellen 54
DUNKELFELDMIKROSKOPIE 58
INTERFERENZMIKROSKOPIE 59
Grundlagen 59
Geräte 61
Meßverfahren 65
Bestimmung der Brechzahl 65
Bestimmung der Schichtdicke 66
Bestimmung der Konzentration 67
Bestimmung der Trockenmasse 67
Schlierenmikroskopie 70
POLARISATIONSMIKROSKOPIE 71
Grundlagen 71
Anwendungen der Polarisationsmikroskopie 78
Ultrastrukturforschung mit dem Polarisationsmikroskop • 78
Histochemische Anwendungen 82
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 83
Grundlagen 83
Optische undpräparative Voraussetzungen 84
Geräte 85
D^is Fluoreszenzmikroskop 85
Das Phasenkontrast-Fluoreszenzmikn iskop 85
Anwendungen 87
Eigenfluoreszenz 87
Fluorochromierung 88
Lokalisierung von Antigen mit fluorochroiniertem Anti
körper 88
REFLEXMIKROSKOPIE 89
PRÄPARATIVE TECHNIK 91
ARBEITEN MIT UNFIXIERTEM MATERIAI 91
Isotonische Lösungen 91
Zellen und Gewebe 91
Zellkerne 92
Chromosomen 92
Isolierungsverfahren 92
Enzymatische Dissoziierung von Geweben 94
Isolierung von Zellkernen 96
Isolierung unfixierter Lampenbürstenehromo somen 97
Beobachtungskammern für unfixierte Präparate 9 8
FIXIERUNG 99
Grundlagen 99
Chemische Fixierung 101
Geschwindigkeit des Eindringens 101
Veränderungen des Dispersionszustandes und des Volumens 101
Fixierlösungen 102
Osmiumsäure 102
Formaldehyd 103
Fixiergemische 104
MIKROTOMIE 106
Mikrotome und Messer 106
Einbettung 107
Die Einbettung in Paraf fin 108
Die Polyäthylenglykol-Methacrylateinbettung 110
Schneiden 111
Zuschneiden und Aufblocken 111
Herstellen und Aufziehen von Paraffinschnitten 112
Herstellen und Aufziehen von Met hacrylatschnitten • 113
Schneiden nach Einbettung in Pol väthylenglykol-
Methacrylat 114
Mikroskopische Untersuchungsverfahren fiir Methncrylat-
schnitte 115
Phasenkontrastmikroskopie ohne Entfernung des Einbet
tungsmittels 115
Phasenkontrastmikroskopie nach Auflösung des
Methacrylats 116
Färbung ohne Entfernung des Einbettungsmittels • • • 116
Färbung nach Auflösung des Einbettungsmittels 116
^ Bestimmung der Schnittdicke 117
FÄRBUNG 118
Mikrotechnische Farbstoffe 118
Die Reaktion der Farbstoffe mit dem Geicebe 118
Färbung mit sauren und basischen Farbstoffen 118
Metachromasie 121
Allgemeine Färbemethoden • • 122
Hämatoxylin nach DELAFIELD 122
Hämalaun nach MAYER 123
Eisenhämatoxvlin nach HEIDENHAIN 123
Chromalaun-Hämatoxylin zur Kern- und Chromosen-
färbung 124
AZAN (AZokarmin-ANilinblau)-Färbung nach HEIDENHAIN 124
Boraxkarmin 125
Cytochemische Färbungen 125
Das Schiffsche Reagens 126
Nachweis von Kohlenhydraten • 129
Die Perjodsäure-ScHifF-Reaktion 129
Chromsäure-ScHivr-Test nach BAUER 129
Glycogen-Färbung nach BEST 130
Nucleinsäuren 130
Die Feulgen-Reaktion für Desoxyribonucleinsäure (DNS) 130
DNS-Färbung mit der Silber-Aldahyd-Methode 131
Fluoreszenzmikroskopisdier DNS-Nachwuis nach STERBA 132
Der enzymatische und hydrolytisihe Abbau der Nucleirisäuren 132
Desoxyribonuclease 132
Ribonuclease 132
RNase und DNase 134
Salzsäure ! 134
Perchlorsäure 134
Trichloressigsäure 134
Färbung der Nucleinsäuren mit Azur B 134
Toluidinblau nach PELLING 134
Methylgriin-Pyronin und andere hasische Farbstoff paare 135
FEVLCEN/Methylenblau-Methode zur Färbung von DNS und
RNS 136
TuRCHmi-Reaktion zur Färbung non RNS und DNS 1 3 6
Die Chromalaun-Gallocyanin-Färbung nach EINARSON 136
Nachweis von DNS und Polysaccharid am gleichen Präparat 137
Kombinierter Nachweis von DNS,Polysaccharid und Protein 137
Proteine 138
Quecksilber-Bromphenolblau 138
Naphtholgelb-Färbung nadi DEITCH 139
Färbung mit „Fast Green bei niedrigem pH 139
Histone und Protamine 139
Histon-Test nadi ALFERT und GESCHWIND 140
Blockierung von Lysin 141
Pikrinsäure-Eosin 141
Pikrinsäure-Bromphenolblau 142
Färbung basisdier Nucleoproteidd mit Biebrich-Rot 1 4 2
SAKAGUCHI-Reaktion für Arginin 142
Die Millon-Reaktion für Tyrosin 143
Sulfhydrylgruppen 144
Lipide 144
Färbung mit Sudan Schwarz B 145
Färbung mit Nilblausulfat 145
Färbung mit saurem Hämatein ntich BAKER 146
Anorganische Stöffe 146
Nachweis von Enzymen 147
Nadiweis der Bernsteinsäure-Dehydrogenase 147
Nachweis von alkalisdier Phosphatase 147
Darstellung bestimmter Zellstrukturen 149
Zellgrenzen 149
Cytoplasma 149
Mitochondrien 150
Vitalfärbung mit Janusgrün B 150
Mitodwndrienfärbung in fixierten Gewehen 150
Mitochondrienfärbung nadi KULI 150
Mitodiondrienfärbung nadi BENHA 151
Mitochondrienfärbung nadi CAIN 152
Nachosmierung der Mitochondrien 152
GoLGi-Systeme 152
Osmierung der GOLGI-Körper 153
Versilberung der GOLGI-Körper 153
Centriole 153
Eisenhämatoxylin 154
Methylenblau-Safranin-Orange G 154
Kristallviolett nach BENDA 154
Kern und Chromosomen 155
Nucleolen 155
AUTORADIOGRAPHIE 155
Grundlagen 155
Herstellung, Verwendung und Spezifität der Vorstufen • • 158
Autoradiographisches Auflösungsoermögen 161
Mikrotechnische Behandlung des Gewebes nach Inkubation 162
Fixierung 162
Vorbereitung der Objektträger 162
Behandlung von Quetschpräparaten und Schnitten • • • 163
Färbung vor Aufziehen der Emulsion 163
Aufziehen der Emulsion 163
„Stripping-Film 163
Flüssige Emulsionen 164
Expositionsdauer 165
Entwickeln und Fixieren 165
Mikroskopische Untersuchung der Autoradiogramme • • 166
Quantitative Auswertung 166
Bahnspurautoradiographie 166
Körnchenzählung 167
Doppelschicht-Autoradiographie 168
Autoradiographische Untersuchung wasserlöslicher Stoffe • 168
Artefakte 168
* Schleier („background) 168
Chemische Artefakte 169
Ausbleichen des latenten Bildes 169
QUANTITATIVE METHODEN 170
MESSUNGEN UND ZÄHLUNGEN AN MIKROSKOPISCHEN
PRÄPARATEN 170
Längenmessung 170
Flächenmessung 171
i Bestimmung des Volumens 171
Bestimmung des relativen Volumanteils nach dem Treffer
prinzip 171
Winkelmessung 172
Zählungen an Suspensionen 172
Zählungen an Schnitten bekannter Dicke 172
MIKROSPEKTROPHOTOMETRIE 173
Grundlagen 173
Anwendungen 175
Geräte 176
Beispiele für Photometer-Anlagen • •• 182
Instrumenteil bedingte Fehler 184
Verstärkungsschwankungen 184
Mangelnde Flächenproportionalität des Ausschlags • • • 185
Streulicht im Gerät 185
Der Einfluß der numerischen Apertur des Kondensors • • 185
Überstrahlungsfehler (SCHWARZSC HILD-VILLIGER-E:ffekt) • 186
Monochromasie-Fehler 187
Meßfehler durch das Objekt 187
Streulicht im Objekt 187
Wellenlängen-abhängige Fehler 189
Verteilungsfehler (Inhomogenität) 189
Proportionalitätsfehler 193
Prüfverfahren zur Ausschaltung von Fehlerquellen • • • 194
MIKRURGISCHE METHODEN 196
MIKROMANIPULATION 196
MIKROSTRAHLENSTICH 198
2 TEIL: ELEKTRONENMIKROSKOP]E 201
GRUNDLAGEN 201
Elektronenlinsen 201
Das Elektronenmikroskop 203
Abbildungseigenschaften der Elektronenlinsen 207
Öffnungsfehler (sphärische Aberration) 207
j Beugungsfehler 208
Auflösungsvermögen 208
Tiefenschärfe 209
Chromatische Aberration 210
Axialer Astigmatismus 211
Bildkontrast 213
PRÄPARATIVE VERFAHREN 214
Objektblenden und Trägernetze 214
Reinigung von Objektblenden und Aperturblenden aus
Platin 215
Trägerfolien und Schutzfolien 215
Formvar-Filme 215
Kollodium-Filme 217
Kohlefolien 217
Schutzfolien 218
Lochfolien 219
Übersicht über die Präparationsverfahren 220
Das Arbeiten mit Suspensionen 220
Spreitung auf Oberflächen 220
Oberflächenabdrücke 220
Gefrierätzung 221
Ultradünnschnitte 221
Fixierung fiir elektronenmikroskopische Arbeiten 2 2 1
Fixierung in gepuffertem Osmiumtetroxyd 221
Fixierlösung nach PALADE 221
Fixiergemisch nach ZETTERQUIST 222
Fixierung nach RYTER und KELLF NBI RGER 222
Fixierung nach MILLONIG 222
Fixierung nadi AFZF LIUS 222
Osmiumsäure-Bichromat-Fixierun ; nach DALTON223
Kaliumpermanganat nadi Luft 224
Fixierung mit gepuffertem Formaldehyd 224
Fixierung mit Glutaraldehyd 225
Fixierung mit Acrolein 225
Gefriertrocknung und Gefriersubstitution 226
Einbettung 226
Allgemeine Verfahren 226
Einbettung in Methacrylat 228
Einbettung in Araldit (Polyepoxyd) 231
Einbettung in Maraglas (Polyepoxyd) 232
Einbettung in Epon 812 (Polyepo-tyd) 233
Einbettung in Vestopal (Polyester) 234
Mit Wasser mischbare Einbettun^smittel 235
Mischeinbettungen 236
Ultramikrotomie 237
Glasmesser 237
Bredien von Glasstreifen 237
Brechen von Glasmessern 238
Bredien vom Streifen 238
Bredien aus Quadraten 239
Messerbredigerät 239
Eigensdiaften und Beurteilung der Messer 240
Der Trog 241
f Diamantmesser 242
Ultramikrotome 242
Ultradünnschnitte 244
Zuspitzen der Blöcke 244
Herstellung von Ultradünnschnitten 244
Lichtmikroskopische Voruntersudiung halbdünner Schnitte 247
Giemsa-Färhung 248
Toluidinblau 248
Hämatoxylin 248
Perjod/ScHiFF-Test für Glycogen und Basalmembranen 249
, Niedersdüagsfärbung mit Kobaltsulfid 249
sKontrastierung 249
Phosphorwolframsäure 250
Uranylacetat 250
Kontrastierung mit alkalischen Bk isalzen 252
Bleikontrastierung nadi KARNOVSKY 252
Bleikontrastierung nadi MILLONIG 253
Bleikontrastierung mit Bleicitrat nach REYNOLDS 253
Doppelkontrastierung mit Uranylacetat und Bleisalzen • 254
Vanadiumsalze 254
Kaliumpermanganat 255
Kontrastierung mit Wismut 255
Nucleinsäure-Kontrastierung mit: Indium 255
Negative Kontrastierung („negative stairiing) 257
Elektronenmikroskopische Ilistochemie 257
Nucleinsäuren 258
DNS-Nachweis mit der Silber-Aldehyd-Reaktion 259
Polysaccharide 260
Glycogen 260
M ucopolysaccharide 260
Anorganische Stoffe 261
Elektronenmikroskopische Autoradiogruphie 261
Die elektronenmikroskopische Aufnahme 264
Fokussierung 264
Belichtung 265
Das Negativmaterial 266
Entwicklung 266
Kopieren 266
QUANTITATIVE AUSWERTUNGEN 267
Bestimmung der Vergrößerung 267
Messung von Abständen im Präparat 267
Messung der vertikalen Ausdehnung 268
Bildanalyse durch Flächenbesthnmungcn • 268
Verwendung von Punktgittern 268
Messungen und Zählungen am Liniengitter 269
Bestimmung von Masse und Dichte 273
ANHANG 274
Kodak D 72 (Universal-P apiere ntwicklcr) 274
1 Reinigungsmittel 274
Pufferlösungen 274
Natriumacetat/Natriumveronalpuffer nach MICHAELIS • • 274
Glycin/HCl-Puffer nach SÖRENSEN 275
Natriumcitrat/HCl-Puffer nach SÖRENSEN 275
Zitronensäure/Na2HP04-Pu!ffer nach MCILVAINE276
Phosphatpuffer nach SÖRENSEN 276
BEZUGSQUELLEN : 278
Chemikalien 278
Biochemica 278
Farbstoffe 278
Radioisotope 278
Sonderverzeichnis von Stoffen 278
Hilfsmittel für die Elektronemnikroskopie 279
ALLGEMEINE LITERATUR 281
LITERATUR 282
STICHWORTVERZEICHNIS 290
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