Biochemisches Praktikum: mit 44 Tab.
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Stuttgart u.a.
Fischer
1988
|
| Ausgabe: | 3. Aufl. |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Lizenzausg. d. Fischer-Verl., Jena. - Literaturangaben |
| Beschreibung: | 263 S. graph. Darst. |
| ISBN: | 3437305913 |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Vorwort zur 2. Auflage............................... 5
Vorwort zur I. Auflage............................... 6
1. Einleitung................................ 12
1.1. Voraussetzungen, Durchführung und Auswertung biochemischer Experimente . . 13
1.1.1. Technische Ausrüstung.......................... 13
1.1.2. Reinheitskriterien............................ 13
1.1.3. Versuchsdurchführung.......................... 14
1.1.4. Auswertung............................... 15
1.2. Arbeitsschutz — Verhalten bei Unfällen................... 16
2. Allgemeine theoretische und praktische Arbeitsgrundlagen und Methoden im biochemi-
schen Labor............................... 17
2.1. Frisch-und Trockenmassebestimmung................... 17
2.2. Zeil-und Gewebeaufschluß........................ 18
2.2.1. Einführung............................... 18
2.2.2. Aufschluß tierischer Zellen......................... 18
2.2.3. Aufschluß von Mikroorganismen...................... 20
2.2.4. Aufschluß pflanzlicher Zellen....................... 21
2.3. Herstellung tiefer und hoher Temperaturen.................. 22
2.3.1. Kältetechnik............................... 22
2.3.2. Wärmetechnik.............................. 23
2.4. Zentrifugation.............................. 24
2.4.1. Einführung............................... 24
2.4.2. Zentrifugationstechniken......................... 24
2.4.3. Besonderheiten präparativer Zentrifugen................... 25
2.4.4. Beschaffenheit der Rotoren........................ 26
2.5. Messung und Konstanthaltung des pH-Wertes................ 27
2.5.1. Bedeutung des pH-Wertes für die lebende Zelle................ 27
2.5.2. Herstellung und Eigenschaften von Pufferlösungen.............. 27
2.5.3. Experimentelle Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration......... 28
2.6. Photometrie............................... 30
2.6.1. Grundlagen der Elektronenspektroskopie.................. 30
2.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz....................... 31
2.6.3. Aufbau und Wirkungsweise von Photometern................ 32
2.6.4. Der optische Test............................. 33
10 Inhaltsverzeichnis
2.7. Enzymatische Testmethoden........................ 35
2.7.1. Einfuhrung............................... 35
2.7.2. Meßgrößen und Einheiten......................... 37
2.7.3. Bestimmung der Enzymaktivität...................... 37
2.7.4. Enzymatische Substratbestimmung — Bestimmung von Pyruvat......... 41
2.8. Qualitative und quantitative Nachweise................... 42
2.8.1. StickstoffFraktionen und ihre Bestimmung.................. 42
2.8.2. Quantitative und qualitative Bestimmung von Aminosäuren.......... 51
2.8.3. Bestimmung von Kohlenhydraten...................... 54
2.8.4. Bestimmung der Lipide.......................... 60
2.8.5. Phosphatfraktionen und ihre Bestimmung.................. 69
3. Trennung, Isolierung und Charakterisierung niedermolekularer Verbindungen .... 72
3.1. Trennung und Identifizierung von Aminosäuren durch eindimensionale Papier-
chromatographie .............................72
3.2. Zweidimensionale Papierchromatographie eines Proteinhydrolysats aus Phaseolus
vulgaris.................................80
3.3. Lösliche Stickstoffmassenstöffe aus Pflanzen: Nachweis von Canavanin und Arginin
in Samen von Canavalia ensiformis mittels dünnschichtchromatographischer
Trennung................................83
3.4. Fraktionierte Extraktion pflanzlichen Materials mittels Ionenaustausch.....87
3.5. Endgruppenbestimmung eines Dipeptids — Darstellung und dünnschichtchromato-
graphische Trennung von 2,4-Dinitrophenyl-(-)Aminosäuren..........93
4. Trennung und Isolierung hochmolekularer Verbindungen.............99
4.1. Isolierung und Bestimmung von Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure aus
Keimlingen von Pisum sativum.......................99
4.2. Isolierung von Glykogen aus der Rattenleber und seine saure und enzymatische
Hydrolyse................................103
4.3. Trennung von Dextranblau, Malatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Trypsin
und Cytochrom c an Sephadex G200....................106
4.4. Nachweis von Isoenzymen und anderen multiplen Enzymformen mittels Polyacryl-
amidgel-Elektrophorese..........................112
4.5. Zweidimensionale Trennung von Proteinen (Methode nach O FARRELL) .... 124
4.6. Reinigung biologisch aktiver Makromoleküle mit Hilfe der Affinitätschromato-
graphie: Verhalten von Hefe-Alkoholdehydrogenase an AMP-Sepharose bzw. Saf-
ranin-Sepharose.............................132
4.7. Präparation kristalliner Alkoholdehydrogenase aus Bäckerhefe mittels Ionen-
austauschchromatographie an DEAE-Cellulose................139
4.8. Immunologische Bestimmung der Konzentration von Immunglobulin G im mensch-
lichen Serum...............................146
Inhaltsverzeichnis 11
5. Charakterisierung und funktionelle Eigenschaften hochmolekularer Verbindungen . . 153
5.1. Quantitative Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Hilfe der
Gelfiltrationstechnik: Bindung von Methylorange an Rinderserumalbumin 153
5.2. Denaturierung und Konformationsänderungen von Makromolekülen: Nachweis
„verborgener Thiolgruppen in Ovalbumin mit Hilfe der Ellmann-Reaktion ... 156
5.3. Charakterisierung funktioneller Proteinregionen und Nachweis von Konformations-
änderungen an Proteinen durch Fluoreszenzspektroskopie...........160
5.4. Kinetische Charakterisierung von Einsubstratreaktionen: Chymotrypsin-katalysierte
Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat.....................166
5.5. Kinetische Charakterisierung von Zweisubstratreaktionen mit tertiärem Komplex:
Oxidation von Alkoholen durch Hefe-AIkoholdehydrogenase (ADH)......176
5.6. Kinetische Charakterisierung der Hydrolyse von N-Benzoyl- D,L-arginin-4-nitro-
anilid durch immobilisiertes Trypsin.....................186
6. Stoffwechsel und Regulation........................191
6.1. Fraktionierung subzellulärer Organellen durch verschiedene Zentrifugationsver-
fahren und Ermittlung der Enzymverteilung.................191
6.2. Untersuchung der Glykolyse in einem zellfreien Hefe-Rohextrakt mit Hilfe der War-
burg-Technik ..............................198
6.3. Atmungskette und oxidative Phosphorylierung: Ermittlung von Respirationskon-
trollindices und P/O-Quotienten sowie die Wirkung von Inhibitoren auf die mito-
chondriale Atmung............................207
6.4. Analyse des photosynthetischen Elektronentransports in isolierten Chloroplasten-
membranen..............................217
6.5. Lichtinduzierter Einbau von Orotsäure-6-14C in die Gesamt-RNA von Euglena
gracilis.................................224
6.6. Mikroautoradiographischer Nachweis des Einbaus von Thymidin-3H in die DNA
des Zellkerns von Allium cepa.......................235
6.7. Nachweis von Urease und Ureaamidolyase durch Bestimmung der *CO2-Frei-
setzung aus radioaktivem Harnstoff.....................238
7. Anhang.................................245
7.1. Herstellung von Pufferlösungen....................... 245
7.2. Herstellung von Ammoniumsulfatlösungen unterschiedlicher Sättigung...... 247
7.3. Molekulargewichte einiger Proteine..................... 249
7.4. Extinktionskoeffizienten einiger biochemisch wichtiger Verbindungen...... 250
7.5. Isoelektrischer Punkt (IP) einiger Proteine.................. 252
7.6. pK-Werte einiger biochemischer Verbindungen................ 253
Sachregister...................................254
Inhaltsverzeichnis
Vorwort zur 2. Auflage............................... 5
Vorwort zur I. Auflage............................... 6
1. Einleitung................................ 12
1.1. Voraussetzungen, Durchführung und Auswertung biochemischer Experimente . . 13
1.1.1. Technische Ausrüstung.......................... 13
1.1.2. Reinheitskriterien............................ 13
1.1.3. Versuchsdurchführung.......................... 14
1.1.4. Auswertung............................... 15
1.2. Arbeitsschutz — Verhalten bei Unfällen................... 16
2. Allgemeine theoretische und praktische Arbeitsgrundlagen und Methoden im biochemi-
schen Labor............................... 17
2.1. Frisch-und Trockenmassebestimmung................... 17
2.2. Zeil-und Gewebeaufschluß........................ 18
2.2.1. Einführung............................... 18
2.2.2. Aufschluß tierischer Zellen......................... 18
2.2.3. Aufschluß von Mikroorganismen...................... 20
2.2.4. Aufschluß pflanzlicher Zellen....................... 21
2.3. Herstellung tiefer und hoher Temperaturen.................. 22
2.3.1. Kältetechnik............................... 22
2.3.2. Wärmetechnik.............................. 23
2.4. Zentrifugation.............................. 24
2.4.1. Einführung............................... 24
2.4.2. Zentrifugationstechniken......................... 24
2.4.3. Besonderheiten präparativer Zentrifugen................... 25
2.4.4. Beschaffenheit der Rotoren........................ 26
2.5. Messung und Konstanthaltung des pH-Wertes................ 27
2.5.1. Bedeutung des pH-Wertes für die lebende Zelle................ 27
2.5.2. Herstellung und Eigenschaften von Pufferlösungen.............. 27
2.5.3. Experimentelle Bestimmung der Wasserstoffionenkonzentration......... 28
2.6. Photometrie............................... 30
2.6.1. Grundlagen der Elektronenspektroskopie.................. 30
2.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz....................... 31
2.6.3. Aufbau und Wirkungsweise von Photometern................ 32
2.6.4. Der optische Test............................. 33
10 Inhaltsverzeichnis
2.7. Enzymatische Testmethoden........................ 35
2.7.1. Einfuhrung............................... 35
2.7.2. Meßgrößen und Einheiten......................... 37
2.7.3. Bestimmung der Enzymaktivität...................... 37
2.7.4. Enzymatische Substratbestimmung — Bestimmung von Pyruvat......... 41
2.8. Qualitative und quantitative Nachweise................... 42
2.8.1. StickstoffFraktionen und ihre Bestimmung.................. 42
2.8.2. Quantitative und qualitative Bestimmung von Aminosäuren.......... 51
2.8.3. Bestimmung von Kohlenhydraten...................... 54
2.8.4. Bestimmung der Lipide.......................... 60
2.8.5. Phosphatfraktionen und ihre Bestimmung.................. 69
3. Trennung, Isolierung und Charakterisierung niedermolekularer Verbindungen .... 72
3.1. Trennung und Identifizierung von Aminosäuren durch eindimensionale Papier-
chromatographie .............................72
3.2. Zweidimensionale Papierchromatographie eines Proteinhydrolysats aus Phaseolus
vulgaris.................................80
3.3. Lösliche Stickstoffmassenstöffe aus Pflanzen: Nachweis von Canavanin und Arginin
in Samen von Canavalia ensiformis mittels dünnschichtchromatographischer
Trennung................................83
3.4. Fraktionierte Extraktion pflanzlichen Materials mittels Ionenaustausch.....87
3.5. Endgruppenbestimmung eines Dipeptids — Darstellung und dünnschichtchromato-
graphische Trennung von 2,4-Dinitrophenyl-(-)Aminosäuren..........93
4. Trennung und Isolierung hochmolekularer Verbindungen.............99
4.1. Isolierung und Bestimmung von Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure aus
Keimlingen von Pisum sativum.......................99
4.2. Isolierung von Glykogen aus der Rattenleber und seine saure und enzymatische
Hydrolyse................................103
4.3. Trennung von Dextranblau, Malatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Trypsin
und Cytochrom c an Sephadex G200....................106
4.4. Nachweis von Isoenzymen und anderen multiplen Enzymformen mittels Polyacryl-
amidgel-Elektrophorese..........................112
4.5. Zweidimensionale Trennung von Proteinen (Methode nach O FARRELL) .... 124
4.6. Reinigung biologisch aktiver Makromoleküle mit Hilfe der Affinitätschromato-
graphie: Verhalten von Hefe-Alkoholdehydrogenase an AMP-Sepharose bzw. Saf-
ranin-Sepharose.............................132
4.7. Präparation kristalliner Alkoholdehydrogenase aus Bäckerhefe mittels Ionen-
austauschchromatographie an DEAE-Cellulose................139
4.8. Immunologische Bestimmung der Konzentration von Immunglobulin G im mensch-
lichen Serum...............................146
Inhaltsverzeichnis 11
5. Charakterisierung und funktionelle Eigenschaften hochmolekularer Verbindungen . . 153
5.1. Quantitative Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mit Hilfe der
Gelfiltrationstechnik: Bindung von Methylorange an Rinderserumalbumin 153
5.2. Denaturierung und Konformationsänderungen von Makromolekülen: Nachweis
„verborgener Thiolgruppen in Ovalbumin mit Hilfe der Ellmann-Reaktion ... 156
5.3. Charakterisierung funktioneller Proteinregionen und Nachweis von Konformations-
änderungen an Proteinen durch Fluoreszenzspektroskopie...........160
5.4. Kinetische Charakterisierung von Einsubstratreaktionen: Chymotrypsin-katalysierte
Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat.....................166
5.5. Kinetische Charakterisierung von Zweisubstratreaktionen mit tertiärem Komplex:
Oxidation von Alkoholen durch Hefe-AIkoholdehydrogenase (ADH)......176
5.6. Kinetische Charakterisierung der Hydrolyse von N-Benzoyl- D,L-arginin-4-nitro-
anilid durch immobilisiertes Trypsin.....................186
6. Stoffwechsel und Regulation........................191
6.1. Fraktionierung subzellulärer Organellen durch verschiedene Zentrifugationsver-
fahren und Ermittlung der Enzymverteilung.................191
6.2. Untersuchung der Glykolyse in einem zellfreien Hefe-Rohextrakt mit Hilfe der War-
burg-Technik ..............................198
6.3. Atmungskette und oxidative Phosphorylierung: Ermittlung von Respirationskon-
trollindices und P/O-Quotienten sowie die Wirkung von Inhibitoren auf die mito-
chondriale Atmung............................207
6.4. Analyse des photosynthetischen Elektronentransports in isolierten Chloroplasten-
membranen..............................217
6.5. Lichtinduzierter Einbau von Orotsäure-6-14C in die Gesamt-RNA von Euglena
gracilis.................................224
6.6. Mikroautoradiographischer Nachweis des Einbaus von Thymidin-3H in die DNA
des Zellkerns von Allium cepa.......................235
6.7. Nachweis von Urease und Ureaamidolyase durch Bestimmung der *CO2-Frei-
setzung aus radioaktivem Harnstoff.....................238
7. Anhang.................................245
7.1. Herstellung von Pufferlösungen....................... 245
7.2. Herstellung von Ammoniumsulfatlösungen unterschiedlicher Sättigung...... 247
7.3. Molekulargewichte einiger Proteine..................... 249
7.4. Extinktionskoeffizienten einiger biochemisch wichtiger Verbindungen...... 250
7.5. Isoelektrischer Punkt (IP) einiger Proteine.................. 252
7.6. pK-Werte einiger biochemischer Verbindungen................ 253
Sachregister...................................254
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