Kombinierte Molekular- und Immuntherapie des Ewing-Sarkoms durch antigen-induzierte Sekretion eines löslichen IGF-1R-Inhibitors durch CAR T-Zellen:
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Münster
2023
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1
INTRODUCTION
.
1
1.1
EWING
SARCOMA
.
1
1.2
IGF-IR
PATHWAY
IN
EWING
SARCOMA
.
1
1.3
IGF-IR
TARGETED
THERAPY
.
3
1.4
CAR
T
CELLS
.
4
1.5
PROJECT
HYPOTHESIS
.
5
1.6
RESEARCH
OBJECTIVES
.
6
2
MATERIAL
AND
METHODS
.
7
2.1
MATERIAL
.
7
2.2
CELL
CULTURE
.
7
2.3
MOLECULAR
BIOLOGY
.
7
2.3.1
CLONING
.
8
2.3.2
COLONY
PCR
.
8
2.3.3
MINIPREP
.
9
2.3.4
MAXIPREP
.
9
2.3.5
TRANSFECTION
.
9
2.3.6
TRANSDUCTION
.
10
2.3.7
INTRACELLULAR
STAINING
OF
SCFV.
10
2.4
SCFV
PRODUCTION
.
11
2.4.1
CONCENTRATING
SCFVS
.
11
2.4.2
DETECTION
OF
SCFVS
.
11
2.5
CHARACTERIZING
IGF-IR
EXPRESSION
IN
EWS
AND
PBMC
.
11
2.6
FUNCTIONAL
ASSAYS
.
12
2.6.1
MTT
ASSAY
.
12
2.6.2
SCFV
BINDING
ASSAY
.
12
2.6.3
WESTERN
BLOT
ANALYSIS
.
12
2.6.4
FLOW
CYTOMETRY
PHENOTYPING
OF
TREATED
EWS
CELLS
.
13
2.7
CONSTITUTIVE
PRODUCTION
OF
IGF-IR
SCFV
IN
HUMAN
T
CELLS
.
13
2.7.1
FLOW
CYTOMETRY
PHENOTYPING
.
14
2.7.2
CD107A
ASSAY.
14
2.7.3
INTRACELLULAR
STAINING
OF
SCFV
.
14
2.8
STATISTICAL
ANALYSIS
.
15
3
RESULTS
.
15
3.1
EWS
CELL
LINES
AND
PBMC
EXPRESS
IGF-IR
.
15
3.2
ANTI-IGF-IR
SCFV
ARE
PRODUCED
IN
TRANSDUCED
HEK
293T
CELLS
.
16
3.3
ANTI-IGF-IR
SCFV
BIND
IGF-IR
ON
EWS
CELLS
.
17
3.4
ANTI-IGF-IR
SCFV
INDUCE
DOWNREGULATION
OF
IGF-IR
EXPRESSION
AND
DOWNSTREAM
SIGNALING
IN
EWS
17
3.5
ANTI-IGF-IR
SCFVS
INHIBIT
PROLIFERATION
OF
EWS
CELLS
.
18
3.6
CONSTITUTIVE
PRODUCTION
OF
ANTI-IGF-LR
SCFV
IN
T
CELLS
DOES
NOT
ALTER
PHENOTYPE
OR
ACTIVATION
RESPONSES
.
19
4
DISCUSSION
.
22
5
REFERENCES
.
29
6
ACKNOWLEDGMENT
.
41
ATTACHMENTS
.
I
I.
MATERIAL
.
I
II.
VECTOR
CONSTRUCTS
.
VI
III.
SUPPLEMENTARY
FIGURES
.
VII
IV.
GATING
STRATEGIES
.
IX
I.
EWS
PHENOTYPE
.
IX
II.
SCFV
BINDING
ASSAY
.
X
III.
PBMC
IMMUNPHAENO
.
XI
IV.
T
CELL
IMMUNPHAENO
.
XII
V.
INTRACELLULAR
STAINING
.
XIII
VI.
CD
107A
ASSAY
.
XIII
IV.
ABBREVIATIONS
.
XIV
V.
LIST
OF
FIGURES
.
XVI
VI.
CURRICULUM
VITAE
.
XIX |
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