Regulation der nukleären Calciumsignale in Kardiomyozyten durch Kationen Kanäle:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Heidelberg
[2023]
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ZUSAMMENFASSUNG
.
V
ABSTRACT
.
VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.VII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
IX
TABELLENVERZEICHNIS
.
XI
FORMELVERZEICHNIS
.
XII
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
CA
2+
ALS
SEKUNDAERER
BOTENSTOFF
IN
ELEKTROMECHANISCHER
KOPPLUNG
DER
VENTRIKULAEREN
KARDIOMYOZYTEN
.
1
1.2
CA
2+
BINDUNGSPROTEINE
UND
MOLEKULARE
PATHOGENESE
DER
KARDIALEN
HYPERTROPHIE
.
4
1.3
NUKLEAERE
CA
2+
SIGNALE
IN
DER
REGULIERUNG
DER
GENEXPRESSION
.
6
1.4
INTERZELLULAERE
CA
2+
SIGNALE
UND
DEREN
URSPRUNG
IN
DER
REGULIERUNG
DER
KARDIALEN
HYPERTROPHIE
7
1.4.1
LONENKANAELE
AN
DER
PLASMAMEMBRAN
ALS
URSPRUNG
FUER
DIE
NUKLEAEREN
CA
2+
SIGNALE
.
7
1.4.2
SARKOPLASMATISCHES
RETIKULUM
UND
IP3R
IN
DER
REGULIERUNG
DER
HYPERTROPHEN
CA
2+
SIGNALE
.
11
1.4.3
LYSOSOMEN
ALS
QUELLE
FUER
DAS
REGULATORISCHE
CA
2+
IM
KARDIALEN
REMODELING
.
12
1.5
MESSUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
CA
2+
KONZENTRATIONEN
.
14
1.5.1
CHEMISCHE
CA
2+
INDIKATOREN
.
14
1.5.2
GENETISCH
EXPRIMIERTE
CA
2+
INDIKATOREN
.
15
1.5.3
REKOMBINANTE
ADENO-ASSOZIIERTE
VIREN
ALS
GENTRANSFERSYSTEME
.
17
1.5.4
PRIMAERE
KARDIOMYOZYTEN
ALS
MODELLSYSTEM
ZUR
MESSUNG
DES
INTRAZELLULAEREN
UND
KOMPARTMENTSPEZIFISCHEN
CA
2+
18
1.5.5
MASTZELLEN
ALS
MODELLSYSTEM
FUER
SOCE
.
19
1.6
ZIEL
DER
ARBEIT
.20
2
MATERIALIEN
.
21
2.1
CHEMIKALIEN
.
21
2.2
PRIMAERZELLEN,
ZELLLINIEN
UND
KULTURMEDIEN
.
23
2.3
PUFFER
UND
SALZLOESUNGEN
.
23
2.4
EXPRESSIONSPLASMIDE
UND
PRIMER
.
26
2.5
WEITERE
MATERIALIEN,
GERAETE
UND
SOFTWARE
.
27
2.6
VERWENDETE
MAUSLINIEN
.
28
3
METHODEN
.29
3.1
PRODUKTION
VON
REKOMBINANTEN
ADENOASSOZIIERTEN
VIREN
(RAAV)
FUER
IN
VITRO
ODER
IN
VIVO
TRANSDUKTION
VON
MAUSKARDIOMYOZYTEN
.29
3.1.1
EXTRAKTION
VON
ENDOTOXINFREIER
PLASMID
DNA
.
29
3.1.2
INKULTURNAHME
UND
VERMEHRUNG
VON
HEK293
T/N
ZELLEN
.
29
3.1.3
TRANSFEKTION
DER
HEK-293
ZELLEN
MIT
AAV
HELFER
UND
GCAMP-TRANSGENPLASMID
.
30
3.1.4
ERNTE,
LYSE
UND
AUFREINIGUNG
DER
RAAV
VEKTOREN
.
30
3.1.5
QUANTIFIZIERUNG
DER
VIRALEN
PARTIKEL
MITTELS
QPCR
.
31
3.2
ISOLATION
VON
VENTRIKULAEREN
MAUSKARDIOMYOZYTEN
.
33
3.2.1
ISOLATION
DER
NEONATALEN
KARDIOMYOZYTEN
.
33
3.2.2
ISOLATION
DER
ADULTEN
KARDIOMYOZYTEN
.
34
3.3
SSAAV
TRANSDUKTION
VON
VENTRIKULAEREN
MAUSKARDIOMYOZYTEN
.
36
3.3.1
SSAAV6
IN
VITRO
TRANSDUKTION
DER
NEONATALEN
KARDIOMYOZYTEN
.
36
3.3.2
SSAAV9
IN
VIVO
INJEKTION
IN
MAEUSEN
.
36
3.3.3
QUANTIFIZIERUNG
DER
SSAAV9
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
.
37
3.4
TAMOXIFEN
VERMITTELTE
AKTIVIERUNG
DER
CRE
REKOMBINASE
.
37
3.5
GEWINNUNG
DER
KNOCHENMARK
ABGELEITETEN
MASTZELLEN
.
38
3.6
ANALYSE
DER
ORAIL
UND
ORAI2
EXPRESSION
IN
KNOCHENMARK
ABGELEITETEN
MASTZELLEN
.
38
3.7
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
CA2*
MESSUNGEN
.
39
3.7.1
RATIOMETRISCHE
MESSUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
CA
2+
-KONZENTRATION
MITHILFE
DES
CHEMISCHEN
CA
2+
INDIKATORS
FURA-2
.
39
3.7.2
MESSUNGEN
DER
NUKLEAEREN
CA
2+
-KONZENTRATION
MITHILFE
DES
GENETISCH
KODIERTEN
CA
2+
SENSORS
GCAMP
IN
PRIMAEREN
MAUSKARDIOMYOZYTEN
.43
3.8
DATENANALYSE
&
STATISTIK
.44
3.8.1
DATENANALYSE
DER
NEONATALE
KARDIOMYOZYTEN
.
45
3.8.2
DATENANALYSE
DER
ADULTEN
KARDIOMYOZYTEN
.45
3.8.3
DATENANALYSE
DER
MASTZELLEN
.46
4
ERGEBNISSE
.47
4.1
KONZEPTIONELLE
UEBERLEGUNGEN
FUER
DAS
EXPERIMENTELLE
DESIGN
VON
CA
2+
MESSUNGEN
.
47
4.1.1
NEONATALE
KARDIOMYOZYTEN
ALS
MODELL
FUER
VERGLEICHENDE
INTRAZELLULAERE
UND
NUKLEAERE
CA
2+
MESSUNGEN
.
47
4.1.2
BEWERTUNG
VON
SSAAV6
VIRALEN
VEKTOREN,
DIE
GCAMP-VARIANTEN
KODIEREN
.
48
4.1.3
VERGLEICHENDE
MESSUNGEN
DER
INTRAZELLULAEREN
UND
NUKLEAEREN
CA
2+
KONZENTRATION
IN
NEONATALEN
KARDIOMYOZYTEN
DER
MAUS
.49
4.2
EINFLUSS
VON
IP3
GENERIERENDEN
REZEPTOR
AGONISTEN
AUF
DIE
CA
2+
HOMOEOSTASE
IN
NEONATALEN
KARDIOMYOZYTEN
.
55
II
4.3
ADULTE
KARDIOMYOZYTEN
ALS
MODELL
FUER
VERGLEICHENDE
INTRAZELLULAERE
CA
2+
MESSUNGEN
.
62
4.4
QUANTIFIZIERUNG
DER
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
VON
SSAAV9
VEKTOREN
IN
ADULTEN
VENTRIKULAEREN
MAUSKARDIOMYOZYTEN
.63
4.5
EVALUIERUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
UND
NUKLEAEREN
CA
2+
MESSUNGEN
IN
NICHT
TRANSDUZIERTEN
UND
SSAAV9_TNT_GCAMP6F.NLS_DSRED
TRANSDUZIERTEN
VENTRIKULAEREN
KARDIOMYOZYTEN
.70
4.5.1
EINFLUSS
VON
SS-ADRENERGEN
UND
IP3
GENERIERENDEN
REZEPTOR
AGONISTEN
AUF
DIE
INTRAZELLULAERE
CA
2+
HOMOEOSTASE
IN
NICHT
TRANSDUZIERTEN
ADULTEN
KARDIOMYOZYTEN
.
70
4.5.2
EINFLUSS
VON
SS-ADRENERGEN
UND
IP3
GENERIERENDEN
REZEPTOR
AGONISTEN
AUF
DIE
NUKLEAERE
CA
2+
HOMOEOSTASE
IN
SSAAV9_TNT_GCAMP6F.NLS_DSRED
TRANSDUZIERTEN
ADULTEN
KARDIOMYOZYTEN
.
72
4.6
SYSTEMATISCHER
VERGLEICH
DER
INTRAZELLULAEREN
UND
NUKLEAEREN
CA
2+
KONZENTRATIONSAENDERUNGEN
IN
SSAAV9_TNT_GCAMP6F.NLS_DSRED
TRANSDUZIERTEN
VENTRIKULAEREN
KARDIOMYOZYTEN
.
74
4.7
ROLLE
DER
NAADP
ABHAENGIGEN
CA
2+
HOMOEOSTASE
FUER
DIE
INTRAZELLULAEREN
UND
NUKLEAEREN
CA
2+
SIGNALE
.
77
4.8
EINFLUSS
DER
INAKTIVIERUNG
VON
OCAR2
AUF
INTRAZELLULAERE
UND
NUKLEAERE
CA
2+
HOMOEOSTASE
.
81
4.9
ANALYSE
VON
MASTZELLEN
AUS
ORAIL
"
1
;
MCPT5
CRE
BZW.
ORAI1F/FX;
MCPT5
CRE/ORAI2
/
'
MAEUSEN
ZUR
IDENTIFIKATION
RELEVANTER
ORAI
SUBTYPEN
BEIM
AGONIST-INDUZIERTEN
CA
2+
EINSTROM
.
83
4.9.1
ANALYSE
DER
ROLLE
VON
CRAC
KANAELEN
AUF
REZEPTOR
MODULIERTE
UND
SPEICHERGESTEUERTE
CA
2+
MOBILISIERUNG
.
85
4.9.2
ANALYSE
DER
ROLLE
DER
ORAI1
PROTEINE
AUF
REZEPTOR
MODULIERTE
UND
SPEICHERGESTEUERTE
CA
2+
MOBILISIERUNG
.
89
4.9.3
ANALYSE
DER
ROLLE
VON
ORAI1
UND
ORAI2
AUF
REZEPTOR
MODULIERTE
UND
SPEICHERGESTEUERTE
CA
2+
MOBILISIERUNG
.
92
4.9.4
EXPRESSIONSANALYSE
VON
ORAI1
UND
ORAI2
IN
MASTZELLEN
AUS
DEM
KNOCHENMARK
.
95
5
DISKUSSION
.97
5.1
NEONATALE
KARDIOMYOZYTEN
ALS
MODELL
FUER
CA
2+
MESSUNGEN
.
97
5.1.1
EVALUIERUNG
DER
GCAMP
UEBEREXPRESSION
UND
DER
GCAMP
MESSUNGEN
IN
KARDIALEN
ZELLEN
.
98
5.1.2
KRITERIEN
FUER
DIE
AUSWAHL
DER
GECI
.
99
5.1.3
STIMULATION
VON
GQ/11
PROTEIN
GEKOPPELTEN
REZEPTOREN
LOEST
KEINE
MESSBARE
VERAENDERUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
ODER
NUKLEAEREN
CA
2+
KONZENTRATION
IN
NEONATALEN
KARDIOMYOZYTEN
AUS
.
100
5.2
ANALYSE
INTRAZELLULAERER
UND
NUKLEAERER
CA
2+
TRANSIENTEN
IN
ELEKTRISCH
STIMULIERTEN
ADULTEN
KARDIOMYOZYTEN
DER
MAUS
.
103
5.2.1
EINFLUSS
DER
AUFREINIGUNG
UND
VERABREICHUNG
DES
SSAAV9
AUF
DIE
TRANSDUKTIONSEFFIZIENZ
.
103
5.2.2
INTRAZELLULAERE
CA
2+
KONZENTRATIONSAENDERUNGEN
NACH
SS-ADRENERGER
UND
GQ/11
PROTEIN
GEKOPPELTER
REZEPTORSTIMULATION
.
106
5.2.3
KOMPARTMENTSPEZIFISCHE
CA
2+
KONZENTRATIONSAENDERUNGEN
IM
NUKLEUS
NACH
SS-ADRENERGER
UND
GQ/11
PROTEIN
GEKOPPELTER
REZEPTORSTIMULATION
.
107
III
5.3
VERGLEICHENDE
MESSUNGEN
DES
INTRAZELLULAEREN
UND
NUKLEAEREN
CA
2+
NACH
SS-ADRENERGER
REZEPTORSTIMULATION
.
110
5.4
ANALYSE
DER
INTRAZELLULAEREN
CA
2+
SIGNALE
NACH
ISO
STIMULATION
DURCH
DEN
NAADP
ANTAGONISTEN
NED19
.
111
5.5
PRIMAERE
MASTZELLEN
AUS
DEM
KNOCHENMARK
ALS
MODELLANSATZ
ZUR
IDENIFIKATION
VON
CA
2+
KANAELEN
IN
DER
PLASMAMEMBRAN
ALS
QUELLE
FUER
NUKLEAERE
CA
2+
SIGANLE
.
113
5.5.1
ANALYSE
DER
ORAI1
EXPRESSION
IN
MASTZELLEN
AUS
DEM
KNOCHENMARK
.
113
5.5.2
ANALYSE
DER
ROLLE
VON
ORAI1
AUF
REZEPTOR
MODULIERTE
UND
SPEICHERGESTEUERTE
CA
2+
MOBILISIERUNG
.
114
5.5.3
ANALYSE
DER
ROLLE
VON
ORAI1
UND
ORAI2
IN
REZEPTOR
MODULIERTER
UND
SPEICHERGESTEUERTER
CA
2+
MOBILISIERUNG
.
115
5.6
FAZIT
UND
AUSBLICK
.
118
LITERATURVERZEICHNIS
.
120
DANKSAGUNG
132
IV |
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