Analyse von Topologie und Assemblierungsverhalten der Calcium-aktivierten Chloridkanäle Anoctamin-1, -2, -5, -6, -9 und -10:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Aachen
[2023]
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
...........................................................................................................
1
1.1
LONENKANALE
..............................................................................................................
1
1.1.1
LIGANDENGESTEUERTE
LONENKANALE
..................................................................
3
1.2
CHLORIDKANALE
..........................................................................................................
4
1.2.1
CALCIUM-AKTIVIERTE
CL--KANALE
(CACC)
.........................................................
4
1.3
FAMILIE
DER
ANOCTAMINE
........................................................................................
6
1.3.1
ENTDECKUNG
....................................................................................................
6
1.3.2
AUFBAU
............................................................................................................
8
1.3.3
AKTIVIERUNG
...................................................................................................
10
1.3.4
FUNKTION
.......................................................................................................
12
1.3.4.1
ANOCTAMIN
1
..........................................................................................
12
1.3.4.2
ANOCTAMIN-2
..........................................................................................
15
1.3.4.3
ANOCTAMIN-3
..........................................................................................
17
1.3.4.4
ANOCTAMIN-4
..........................................................................................
17
1.3.4.5
ANOCTAMIN-5
..........................................................................................
17
1.3.4.6
ANOCTAMIN-6
..........................................................................................
18
1.3.4.7
ANOCTAMIN
7
..........................................................................................
19
1.3.4.8
ANOCTAMIN-8
..........................................................................................
20
1.3.4.9
ANOCTAMIN-9
..........................................................................................
20
1.3.4.10
ANOCTAMIN
10
.......................................................................................
21
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
..................................................................................
22
3
MATERIAL
UND
METHODEN
...............................................................................
23
3.1
KLONIERUNG
............................................................................................................
23
3.1.1
GERICHTETE
MUTAGENESE
..............................................................................
23
3.1.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
..........................................................................
24
3.1.3
MEGAPRIMER-PCR
.......................................................................................
25
3.1.4
DNA-AUFREINIGUNG
......................................................................................
28
3.1.5
CRNA-SYNTHESE
...........................................................................................
28
3.2
PROTEINEXPRESSION
IN
XENOPUS
...............................................................................
29
3.2.1
GEWINNUNG
DER
OOZYTEN
............................................................................
29
3.2.2
RNA-INJEKTION
IN
XENOPUS
..........................................................................
30
3.2.3
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
L-[
35
S]-METHIONIN
....................................
31
3.3
FLUORESZENZMARKIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
........................................................
31
3.3.1
OBERFLACHENFARBUNG
...................................................................................
31
3.3.2
HOMOGENISATION
..........................................................................................
32
3.3.3
....
.......................................................................................................................
32
3.3.4
.......................................................................................................................
34
3.3.5
IMMUNPRAZIPITATION
...................................................................................
34
3.4
PROTEINAUFTRENNUNG
MITTELS
PAGE
......................................................................
35
3.4.1
FUNKTIONSPRINZIP
DER
PAGE
.......................................................................
35
3.4.2
SDS-PAGE
..................................................................................................
37
3.4.3
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
SDS-PAGE
...............
38
3.4.4
BN-PAGE
....................................................................................................
38
3.4.5
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
BN-PAGE
.................
39
3.4.6
FLUORESZENZ-IMAGING
....................................................................................40
3.4.7
........................................................................................................................
40
4
ERGEBNISSE
.............................................
42
4.1
UEBERPRUEFUNG
DER
TOPOLOGIE
VON
ANOCTAMIN-6
.................................................
42
4.1.1
VERSUCHSPRINZIP
............................................................................................
43
4.1.2
OBERFLAECHEN
UND
GESAMTEXPRESSION
VON
MANO6-HIS
UND
DER
CYSTEIN
MUTANTEN
.......................................................................................................
45
4.1.3
MARKIERUNG
VON
MANO6-HIS
UND
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
MIT
IR800
MALEIMID
AN
DER
ZELLOBERFLACHE
..................................................................
52
4.2
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
DER
ANOCTAMINE
........................................................
56
4.2.1
ETABLIERUNG
EINER
VERSUCHSMETHODE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
COASSEMBLIERUNG
..........................................................................................
56
4.2.2
ANALYSE
DER
HOMO
UND
HETEROASSEMBLIERUNG
DER ANOCTAMINE
.............
69
4.2.3
IMMUNPRAZIPITATION
ZUR
ASSEMBLIERUNGSANALYSE
.......................................
75
4.2.4
AXOLOTL
............................................................................................................80
5
DISKUSSION
........................................................................................................
85
5.1
EINLEITUNG
...............................................................................................................
85
5.2
DIE
UEBERPRUEFUNG
DER
TOPOLOGIE
VON
ANOCTAMIN-6
ERFORDERT
EINE
REVISION
DES
STRUKTURMODELLS
.....................................................................................
85
5.3
ANOCTAMIN
1
LIEGT
ALS
HOMODIMER
VOR
...............................................................
87
5.4
ANOCTAMIN-6
UND
-10
BILDEN
EBENFALLS
HOMODIMERE
.......................................
89
5.5
SCHWACHE
BZW.
FEHLENDE
PROTEINEXPRESSION
VERHINDERT
EINE
AUSSAGE
UEBER
DAS
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
VON
ANOCTAMIN-2,
-5
UND-9
......................
90
5.6
EINIGE
ANOCTAMINE
SIND
INTRAZELLULARE
PROTEINE
................................................
91
5.7
MOEGLICHE
URSACHEN
DER
UNTERSCHIEDLICHEN
STARKEN
PROTEINEXPRESSION
............
92
5.7.1
ANOCTAMIN-6
WIRD
IM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
ZURUCKGEHALTEN
..
92
5.7.2
ZELLSPEZIFISCHE
MECHANISMEN
BEEINFLUSSEN
DIE
ANOCTAMIN
PROTEINEXPRESSION
.........................................................................................
93
5.7.3
DIE
EINZELNEN
ANOCTAMINE
INTERAGIEREN
UNTEREINANDER
............................
94
5.7.4
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
HANO6
UND
MANOOE
...............................................
95
5.8
AUSWIRKUNG
VON
GERICHTETER
MUTAGENESE
UND
VERSUCHSBEDINGUNGEN
AUF
DIE
PROTEINEXPRESSION
..................................................................................
95
5.8.1
AUSWIRKUNGEN
DER
GERICHTETEN
MUTAGENESE
...............................................
95
5.8.2
MOEGLICHE
EINFLUSSNAHME
DURCH
EXPRESSION
VON
GFP
...............................
97
5.8.3
EINE
HOEHERE
BIOTINKONZENTRATION
IM
ELUTIONSPUFFER
FUHRT
ZU
EINER
BESSEREN
PROTEINAUSBEUTE
............................................................................................
99
5.9
SUCHE
EINER
VERSUCHSMETHODE
ZUR
ANALYSE
DES
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
......
99
6
ZUSAMMENFASSUNG
........................................................................................
102
7
LITERATUR
...........................................................................................................
103
8
ANHANG
..............................................................................................................
114
8.1
VERWENDETE
MEDIEN
UND
PUFFER
........................................................................
114
8.2
VERZEICHNIS
DER
BEZUGSFIRMEN
...........................................................................
119
8.3
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.......................................................................................
120
8.4
TABELLENVERZEICHNIS
............................................................................................
121
8.5
EIGENE
PUBLIKATIONEN
..........................................................................................
122
8.6
DANKSAGUNG
........................................................................................................
123
8.7
ERKLAERUNG
ZUR
DATENAUFBEWAHRUNG
...................................................................
124
8.8
ERKLAERUNG
UEBER
DEN
EIGENANTEIL
.........................................................................
125
8.9
LEBENSLAUF
............................................................................................................
126
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
LONENKANALE
.
1
1.1.1
LIGANDENGESTEUERTE
LONENKANALE
.
3
1.2
CHLORIDKANALE
.
4
1.2.1
CALCIUM-AKTIVIERTE
CL--KANALE
(CACC)
.
4
1.3
FAMILIE
DER
ANOCTAMINE
.
6
1.3.1
ENTDECKUNG
.
6
1.3.2
AUFBAU
.
8
1.3.3
AKTIVIERUNG
.
10
1.3.4
FUNKTION
.
12
1.3.4.1
ANOCTAMIN
1
.
12
1.3.4.2
ANOCTAMIN-2
.
15
1.3.4.3
ANOCTAMIN-3
.
17
1.3.4.4
ANOCTAMIN-4
.
17
1.3.4.5
ANOCTAMIN-5
.
17
1.3.4.6
ANOCTAMIN-6
.
18
1.3.4.7
ANOCTAMIN
7
.
19
1.3.4.8
ANOCTAMIN-8
.
20
1.3.4.9
ANOCTAMIN-9
.
20
1.3.4.10
ANOCTAMIN
10
.
21
2
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
22
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
23
3.1
KLONIERUNG
.
23
3.1.1
GERICHTETE
MUTAGENESE
.
23
3.1.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
24
3.1.3
MEGAPRIMER-PCR
.
25
3.1.4
DNA-AUFREINIGUNG
.
28
3.1.5
CRNA-SYNTHESE
.
28
3.2
PROTEINEXPRESSION
IN
XENOPUS
.
29
3.2.1
GEWINNUNG
DER
OOZYTEN
.
29
3.2.2
RNA-INJEKTION
IN
XENOPUS
.
30
3.2.3
METABOLISCHE
MARKIERUNG
MIT
L-[
35
S]-METHIONIN
.
31
3.3
FLUORESZENZMARKIERUNG
UND
AUFREINIGUNG
.
31
3.3.1
OBERFLACHENFARBUNG
.
31
3.3.2
HOMOGENISATION
.
32
3.3.3
.
.
32
3.3.4
.
34
3.3.5
IMMUNPRAZIPITATION
.
34
3.4
PROTEINAUFTRENNUNG
MITTELS
PAGE
.
35
3.4.1
FUNKTIONSPRINZIP
DER
PAGE
.
35
3.4.2
SDS-PAGE
.
37
3.4.3
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
SDS-PAGE
.
38
3.4.4
BN-PAGE
.
38
3.4.5
VORBEREITUNG
DER
PROBEN
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
BN-PAGE
.
39
3.4.6
FLUORESZENZ-IMAGING
.40
3.4.7
.
40
4
ERGEBNISSE
.
42
4.1
UEBERPRUEFUNG
DER
TOPOLOGIE
VON
ANOCTAMIN-6
.
42
4.1.1
VERSUCHSPRINZIP
.
43
4.1.2
OBERFLAECHEN
UND
GESAMTEXPRESSION
VON
MANO6-HIS
UND
DER
CYSTEIN
MUTANTEN
.
45
4.1.3
MARKIERUNG
VON
MANO6-HIS
UND
DER
CYSTEIN-MUTANTEN
MIT
IR800
MALEIMID
AN
DER
ZELLOBERFLACHE
.
52
4.2
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
DER
ANOCTAMINE
.
56
4.2.1
ETABLIERUNG
EINER
VERSUCHSMETHODE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
COASSEMBLIERUNG
.
56
4.2.2
ANALYSE
DER
HOMO
UND
HETEROASSEMBLIERUNG
DER ANOCTAMINE
.
69
4.2.3
IMMUNPRAZIPITATION
ZUR
ASSEMBLIERUNGSANALYSE
.
75
4.2.4
AXOLOTL
.80
5
DISKUSSION
.
85
5.1
EINLEITUNG
.
85
5.2
DIE
UEBERPRUEFUNG
DER
TOPOLOGIE
VON
ANOCTAMIN-6
ERFORDERT
EINE
REVISION
DES
STRUKTURMODELLS
.
85
5.3
ANOCTAMIN
1
LIEGT
ALS
HOMODIMER
VOR
.
87
5.4
ANOCTAMIN-6
UND
-10
BILDEN
EBENFALLS
HOMODIMERE
.
89
5.5
SCHWACHE
BZW.
FEHLENDE
PROTEINEXPRESSION
VERHINDERT
EINE
AUSSAGE
UEBER
DAS
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
VON
ANOCTAMIN-2,
-5
UND-9
.
90
5.6
EINIGE
ANOCTAMINE
SIND
INTRAZELLULARE
PROTEINE
.
91
5.7
MOEGLICHE
URSACHEN
DER
UNTERSCHIEDLICHEN
STARKEN
PROTEINEXPRESSION
.
92
5.7.1
ANOCTAMIN-6
WIRD
IM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
ZURUCKGEHALTEN
.
92
5.7.2
ZELLSPEZIFISCHE
MECHANISMEN
BEEINFLUSSEN
DIE
ANOCTAMIN
PROTEINEXPRESSION
.
93
5.7.3
DIE
EINZELNEN
ANOCTAMINE
INTERAGIEREN
UNTEREINANDER
.
94
5.7.4
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
HANO6
UND
MANOOE
.
95
5.8
AUSWIRKUNG
VON
GERICHTETER
MUTAGENESE
UND
VERSUCHSBEDINGUNGEN
AUF
DIE
PROTEINEXPRESSION
.
95
5.8.1
AUSWIRKUNGEN
DER
GERICHTETEN
MUTAGENESE
.
95
5.8.2
MOEGLICHE
EINFLUSSNAHME
DURCH
EXPRESSION
VON
GFP
.
97
5.8.3
EINE
HOEHERE
BIOTINKONZENTRATION
IM
ELUTIONSPUFFER
FUHRT
ZU
EINER
BESSEREN
PROTEINAUSBEUTE
.
99
5.9
SUCHE
EINER
VERSUCHSMETHODE
ZUR
ANALYSE
DES
ASSEMBLIERUNGSVERHALTEN
.
99
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
102
7
LITERATUR
.
103
8
ANHANG
.
114
8.1
VERWENDETE
MEDIEN
UND
PUFFER
.
114
8.2
VERZEICHNIS
DER
BEZUGSFIRMEN
.
119
8.3
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
120
8.4
TABELLENVERZEICHNIS
.
121
8.5
EIGENE
PUBLIKATIONEN
.
122
8.6
DANKSAGUNG
.
123
8.7
ERKLAERUNG
ZUR
DATENAUFBEWAHRUNG
.
124
8.8
ERKLAERUNG
UEBER
DEN
EIGENANTEIL
.
125
8.9
LEBENSLAUF
.
126 |
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