Die Einflüsse von dynamisch-mechanischer Belastung, TGF-β1 und BMP2 auf die chondrogene Differenzierung humaner synovialer Stammzellen in vitro:
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Freiburg im Breisgau
[2022]
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ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
............................................................................................................
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
FUER
GENE
UND
GENPRODUKTE...............................................................
10
1
EINLEITUNG
........................................................................................................................
11
1.1
SCHAEDEN
DES
GELENKKNORPELS
...................................................................................
11
1.2
TISSUE
ENGINEERING
..................................................................................................
11
1.3
STAMMZELLTHERAPIE
...................................................................................................
12
1.3.1
MESENCHYMALE
STAMMZELLEN.............................................................................
12
1.3.1.1
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
MESENCHYMALER
STAMMZELLEN
...................
13
1.3.1.2
MESENCHYMALE
STAMMZELLEN
AUS
DER
SYNOVIALMEMBRAN
..........................
15
1.3.2
MATRIX
.................
17
1.4
MECHANISCHE
BELASTUNG
..........................................................................................
17
1.4.1
IN
VIVO
...............................................................................................................
17
1.4.2
IN
VITRO
...............................................................................................................
18
1.5
WACHSTUMSFAKTOREN
.................................................................................................
19
1.5.1
TRANSFORMIERENDER
WACHSTUMSFAKTOR-SS1
..........................................................
19
1.5.2
KNOCHENMORPHOGENETISCHES
PROTEIN
2
.............................................................
20
1.6
ZIEL
UND
FRAGESTELLUNG
..............................................................................................
21
2
MATERIAL
UND
METHODEN
...................................................................................................
23
2.1
EXPERIMENTELLES
DESIGN
............................................................................................
23
2.2
ALLGEMEINES
.............................................................................................................
25
2.3
LISTE
DER
VERWENDETEN
MATERIALIEN
...........................................................................
25
2.4
ZELLKULTUR
..................................................................................................................
31
2.4.1
ISOLATIONS-UND
EXPANSIONSPHASE.....................................................................
31
2.4.1.1
GEWINNUNG
DES
GEWEBES
..........................................................................
32
2.4.1.2
ISOLATION
DER
ZELLEN
....................................................................................
32
2.4.1.3
EXPANSION
UND
SUBKULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
..................................................
33
2.4.1.4
KRYOKONSERVIERUNG
UND
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.............................................
35
2.4.2
GRUPPENSPEZIFISCHE
PHASE
..............................................................................
35
2.4.2.1
HERSTELLUNG
DER
GRUPPENSPEZIFISCHEN
NAEHRMEDIEN
...................................
36
4
2.4.2.2
HERSTELLUNG
DER
SDSCS-FIBRIN-POLYURETHAN-KONSTRUKTE
.............................
36
2.4.2.3
MECHANISCHER
BELASTUNGSZYKLUS
................................................................
38
2.4.2.4
WECHSEL
DES
NAEHRMEDIUMS
UND
PROBENGEWINNUNG
..................................
39
2.4.2.5
BEENDIGUNG
DES
EXPERIMENTS
UND
PROBENGEWINNUNG
...............................
39
2.5
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
..........................................................................................
40
2.5.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
..................................................................................40
2.5.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
....................
41
2.5.2.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN..............................
41
2.5.2.2
QUANTIFIZIERUNG
DER
DNA
............................................................................
41
2.5.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
............................................................
42
2.5.3.1
BMP2
ELISA
..............................................................................................
43
2.5.3.2
TGF-SS1
ELISA
...........................................................................................
43
2.6
GENOMIK...................................................................................................................44
2.6.1
RNA
ISOLATION
....................................................................................................
44
2.6.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
.......................................................................................
45
2.6.3
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
............................................................................
45
2.7
HISTOLOGIE
.................................................................................................................
48
2.7.1
FIXIERUNG
...........................................................................................................48
2.7.2
PARAFFINEINBETTUNG
UND
ERSTELLEN
DER
SCHNITTE
...................................................
48
2.7.3
SAFRANIN
O-/FAST
GREEN-FAERBUNG
......................................................................
48
2.8
STATISTIK
....................................................................................................................49
3
ERGEBNISSE
......................................................................................................................
50
3.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
...........................................................................................
50
3.1.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
..................................................................................
50
3.1.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
....................
52
3.1.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.............................................................
56
3.1.3.1
BMP2
ELISA
.............................................................................................
56
3.1.3.2
TGF-SS1
ELISA
..........................................................................................
59
3.2
GENOMIK...................................................................................................................
62
3.2.1
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
............................................................................
62
5
3.2.1.1
REZEPTOREN
................................................................................................
62
3.2.1.2
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
................................................................................
64
3.2.1.3
MATRIXPROTEINE
............................................................................................
67
3.2.1.4
KATABOLE
MARKER
.........................................................................................
70
3.3
HISTOLOGIE
.................................................................................................................
71
4
DISKUSSION
.......................................................................................................................
73
4.1
DISKUSSION
DER
METHODEN
........................................................................................
73
4.1.1
ZELLKULTUR
..........................................................................................................
73
4.1.1.1
ISOLATIONS
UND
EXPANSIONSPHASE
...............................................................
73
4.1.1.2
GRUPPENSPEZIFISCHE
PHASE
.......................................................................
75
4.1.2
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
...................................................................................
78
4.1.2.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
............................................................................
78
4.1.2.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
..............
79
4.1.2.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.......................................................
80
4.1.3
GENOMIK
.............................................................................................................
82
4.1.3.1
RNA
ISOLATION
.............................................................................................
82
4.1.3.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
................................................................................
82
4.1.3.3 QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
......................................................................
82
4.1.4
HISTOLOGIE
...........................................................................................................
82
4.1.5
STATISTIK
..............................................................................................................
83
4.2
DISKUSSION
DER
ERGEBNISSE
......................................................................................
84
4.2.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
....................................................................................
84
4.2.1.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
............................................................................
84
4.2.1.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
..............
84
4.2.1.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.......................................................
85
4.2.2
GENOMIK
............................................................................................................
87
4.2.2.1
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
......................................................................
87
4.2.3
HISTOLOGIE
...........................................................................................................
91
ZUSAMMENFASSUNG
...............................................................................................................
94
LITERATURVERZEICHNIS
..............................................................................................................
95
6
PUBLIKATION............................................................................................................................
121
LEBENSLAUF
............................................................................................................................
122
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
................................................................................................
123
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
....................................................................................................
124
DANKSAGUNG
.........................................................................................................................
125
7
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
FUER
GENE
UND
GENPRODUKTE.
10
1
EINLEITUNG
.
11
1.1
SCHAEDEN
DES
GELENKKNORPELS
.
11
1.2
TISSUE
ENGINEERING
.
11
1.3
STAMMZELLTHERAPIE
.
12
1.3.1
MESENCHYMALE
STAMMZELLEN.
12
1.3.1.1
CHONDROGENE
DIFFERENZIERUNG
MESENCHYMALER
STAMMZELLEN
.
13
1.3.1.2
MESENCHYMALE
STAMMZELLEN
AUS
DER
SYNOVIALMEMBRAN
.
15
1.3.2
MATRIX
.
17
1.4
MECHANISCHE
BELASTUNG
.
17
1.4.1
IN
VIVO
.
17
1.4.2
IN
VITRO
.
18
1.5
WACHSTUMSFAKTOREN
.
19
1.5.1
TRANSFORMIERENDER
WACHSTUMSFAKTOR-SS1
.
19
1.5.2
KNOCHENMORPHOGENETISCHES
PROTEIN
2
.
20
1.6
ZIEL
UND
FRAGESTELLUNG
.
21
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
23
2.1
EXPERIMENTELLES
DESIGN
.
23
2.2
ALLGEMEINES
.
25
2.3
LISTE
DER
VERWENDETEN
MATERIALIEN
.
25
2.4
ZELLKULTUR
.
31
2.4.1
ISOLATIONS-UND
EXPANSIONSPHASE.
31
2.4.1.1
GEWINNUNG
DES
GEWEBES
.
32
2.4.1.2
ISOLATION
DER
ZELLEN
.
32
2.4.1.3
EXPANSION
UND
SUBKULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
.
33
2.4.1.4
KRYOKONSERVIERUNG
UND
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.
35
2.4.2
GRUPPENSPEZIFISCHE
PHASE
.
35
2.4.2.1
HERSTELLUNG
DER
GRUPPENSPEZIFISCHEN
NAEHRMEDIEN
.
36
4
2.4.2.2
HERSTELLUNG
DER
SDSCS-FIBRIN-POLYURETHAN-KONSTRUKTE
.
36
2.4.2.3
MECHANISCHER
BELASTUNGSZYKLUS
.
38
2.4.2.4
WECHSEL
DES
NAEHRMEDIUMS
UND
PROBENGEWINNUNG
.
39
2.4.2.5
BEENDIGUNG
DES
EXPERIMENTS
UND
PROBENGEWINNUNG
.
39
2.5
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
.
40
2.5.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
.40
2.5.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
.
41
2.5.2.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN.
41
2.5.2.2
QUANTIFIZIERUNG
DER
DNA
.
41
2.5.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
42
2.5.3.1
BMP2
ELISA
.
43
2.5.3.2
TGF-SS1
ELISA
.
43
2.6
GENOMIK.44
2.6.1
RNA
ISOLATION
.
44
2.6.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
45
2.6.3
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
.
45
2.7
HISTOLOGIE
.
48
2.7.1
FIXIERUNG
.48
2.7.2
PARAFFINEINBETTUNG
UND
ERSTELLEN
DER
SCHNITTE
.
48
2.7.3
SAFRANIN
O-/FAST
GREEN-FAERBUNG
.
48
2.8
STATISTIK
.49
3
ERGEBNISSE
.
50
3.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
.
50
3.1.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
.
50
3.1.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
.
52
3.1.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
56
3.1.3.1
BMP2
ELISA
.
56
3.1.3.2
TGF-SS1
ELISA
.
59
3.2
GENOMIK.
62
3.2.1
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
.
62
5
3.2.1.1
REZEPTOREN
.
62
3.2.1.2
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
64
3.2.1.3
MATRIXPROTEINE
.
67
3.2.1.4
KATABOLE
MARKER
.
70
3.3
HISTOLOGIE
.
71
4
DISKUSSION
.
73
4.1
DISKUSSION
DER
METHODEN
.
73
4.1.1
ZELLKULTUR
.
73
4.1.1.1
ISOLATIONS
UND
EXPANSIONSPHASE
.
73
4.1.1.2
GRUPPENSPEZIFISCHE
PHASE
.
75
4.1.2
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
.
78
4.1.2.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
.
78
4.1.2.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
.
79
4.1.2.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
80
4.1.3
GENOMIK
.
82
4.1.3.1
RNA
ISOLATION
.
82
4.1.3.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
82
4.1.3.3 QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
.
82
4.1.4
HISTOLOGIE
.
82
4.1.5
STATISTIK
.
83
4.2
DISKUSSION
DER
ERGEBNISSE
.
84
4.2.1
BIOCHEMISCHE
ANALYSEN
.
84
4.2.1.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NITRIT
.
84
4.2.1.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
SULFATIERTEN
GLYKOSAMINOGLYKANEN
UND
DNA
.
84
4.2.1.3
ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
.
85
4.2.2
GENOMIK
.
87
4.2.2.1
QUANTITATIVE
REAL-TIME
PCR
.
87
4.2.3
HISTOLOGIE
.
91
ZUSAMMENFASSUNG
.
94
LITERATURVERZEICHNIS
.
95
6
PUBLIKATION.
121
LEBENSLAUF
.
122
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
.
123
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
.
124
DANKSAGUNG
.
125
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